重组人干扰素α冷冻干燥工艺优化：基于保护剂选择与工艺参数的稳 定性提升研究

摘要 冷冻干燥技术是蛋白类药物制剂开发中的关键步骤 ，能够通过去除水分降 低降解风险，显著提高药物的稳定性和储存性能。然而，重组人干扰素α（IFN-α) 在冷冻干燥过程中易受冷冻和干燥应力的影响，导致结构变性、活性丧失及化学 降解 。本研究以IFN-α为研究对象 ，系统优化了冷冻干燥工艺 ，重点评估了保护 剂组合、预冻速率和升华温度对其稳定性的影响。结果表明，蔗糖与海藻糖按 2:1 比例组合显著提高了IFN-α的残余活性（94.3%）和二级结构完整性 。快速预冻 （-80℃)  形成均匀分布的微小冰晶 ，有效减少了冷冻应力 ；低温升华（-30℃)   进一步降低了化学降解和聚集发生率 （降解产物比例降至 3.2%， 聚集率仅为 4.2%）。优化后的冷冻干燥工艺使IFN-α的活性和物理化学性质显著优于未优化 条件 。本研究为IFN-α及其他蛋白类药物的冷冻干燥工艺优化提供了理论依据 ， 并对工业化开发具有重要意义。

关键词 冷冻干燥；重组人干扰素α;  稳定性；保护剂；预冻速率；升华温度

重组人干扰素α（Recombinant Human Interferon-α, IFN-α)  是一种多功能的蛋白类 药物，广泛应用于抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等领域[1-4]。其通过与细胞表面干扰

素受体结合，激活下游信号通路以抑制病毒复制、诱导细胞凋亡并调控免疫反应 [5-6] 。然而 ，作为一种复杂的大分子 ，IFN-α的稳定性对环境条件极为敏感 。在储 存 、运输及制剂加工过程中 ，冷冻应力 、干燥应力及氧化作用可能导致IFN-α分 子发生降解或聚集 ，进而影响疗效与安全性[7-8]。

冷冻干燥技术因其能够显著延长蛋白类药物的货架期和储存稳定性 ，成为开发 IFN-α制剂的核心技术[9]。冷冻干燥通过将蛋白质溶液冷冻为固态并在低温低压条 件下去除冰晶，减少分子间的水合作用和化学反应[10]。然而，冷冻和干燥阶段可 能对蛋白质造成不利影响：在冷冻阶段，冰晶形成和溶质浓缩可能引发结构变性 或聚集；在干燥阶段 ，水分缺乏可能破坏蛋白质的二级和三级结构[11] 。因此，优 化冷冻干燥工艺并选择适当的保护剂成为解决这些问题的关键。

保护剂通过形成玻璃态保护层或替代水分子与蛋白质相互作用，能够有效减轻蛋  白质的结构损伤[12]。蔗糖、海藻糖等糖类保护剂因其较高的玻璃化转变温度（Tg） 和良好的生物相容性，是常用的选择[13]。此外，冷冻干燥工艺参数（如预冻速率  和升华温度）也直接影响蛋白质的稳定性。快速预冻形成的微小均匀冰晶能够显  著减少机械应力，而较低的升华温度有助于抑制化学降解反应，提升干燥后产品  的质量[14-15]。

基于上述背景 ，本研究以IFN-α为模型蛋白 ，系统优化冷冻干燥工艺条件 ，筛选 最佳保护剂组合并探讨预冻速率与升华温度对其稳定性的影响。通过对冷冻干燥 后 IFN-α活性 、二级结构和化学稳定性的综合评估 ，提出适用于工业化开发的优 化方案 。本研究不仅为IFN-α制剂开发提供理论依据 ，也为其他蛋白类药物的冷 冻干燥技术应用提供参考。

材料和方法

本研究以重组人干扰素α（IFN-α)  为研究对象 ，购自 Thermo Fisher Scientific，纯 度超过 95%。保护剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇和聚乙二醇（PEG），均为分析纯 级别 ，购自 Sigma-Aldrich 。溶解缓冲液为 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS），实验 用水为通过 Milli-Q® IQ 7000 系统（Merck）制备的超纯水 。所有试剂在实验前 均经过严格质量检验以确保其纯度和稳定性。

IFN-α溶液的初始浓度为 1 mg/mL ，与不同保护剂组合混合 ，保护剂组合包括蔗 糖单一组 、海藻糖单一组 、蔗糖与海藻糖按 2:1 比例组合组 、以及蔗糖与甘露醇 按 1:1 比例组合组。混合均匀后，溶液分装于 2 mL 安瓿瓶（SCHOTT Type I Plus® Glass Vials），每瓶装量为 1.0 mL，并密封以确保实验的重复性和稳定性。

冻干样品的聚集水平通过动态光散射（DLS）测定，仪器为 Malvern Zetasizer Nano ZS ，将冻干粉溶解于 PBS 缓冲液（pH 7.4），在 25℃下记录粒径分布和聚集率。 每个样品测定 3 次以确保结果的重复性 。此外 ，冻干粉的溶解性通过将 1.0 mg 冻干粉溶解于 1 mL PBS（pH 7.4）测定，记录样品完全溶解所需时间，并观察溶 液的透明度和浑浊度 ，溶解测试在室温（25℃)  下进行。

样品的稳定性通过一系列实验评价，包括残余活性测定（使用酶联免疫吸附试验，

Thermo Scientific™ Multiskan™ FC 酶标仪）、二级结构变化（使用傅里叶变换红  外光谱，Bruker Tensor II 红外光谱仪）分析，以及化学稳定性测试（通过高效液  相色谱 ，Agilent 1260 Infinity II ，测定降解产物的生成情况并计算降解峰面积比  例）。此外，样品的玻璃化转变温度（Tg）通过差示扫描量热仪（DSC，TA Instruments  Q2000）测定，残余水分含量通过卡尔费休水分滴定法（Metrohm 915 KF Ti-Touch） 测定。

所有实验均至少重复三次 ，数据以均值±标准差表示 。不同组别之间的差异通过 单因素方差分析（ANOVA）进行比较 ，显著性水平设定为 P < 0.05。实验数据的 整理与可视化分析使用 Origin Pro 2023（OriginLab）软件完成。

结果与讨论

通过冷冻干燥工艺优化研究发现 ，保护剂配方 、预冻速率和升华温度对IFN-α的 稳定性有显著影响 。首先 ，不同保护剂组合对IFN-α的保护效果存在显著差异。 在单一保护剂的情况下 ，蔗糖和海藻糖均对IFN-α提供了一定程度的稳定性，其 中海藻糖组的残余活性高于蔗糖组 ，分别为 88.5%和 86.7% 。这种差异可能与海 藻糖较高的玻璃化转变温度（Tg）有关，它能够更有效地维持蛋白质在干燥阶段 的结构稳定性 。蔗糖与海藻糖按 2:1 比例组合时 ，表现出显著的协同保护效果 ， 残余活性达到 94.3%， 比单一保护剂组提高了 5%以上 。此外 ，与蔗糖-海藻糖组 合相比 ，蔗糖-甘露醇组合的保护效果较差 ，其残余活性仅为 82.3% 。通过 DSC 分析发现 ，甘露醇在冷冻干燥过程中容易结晶化 ，降低了其保护蛋白质的能力， 这与其他研究的结论一致。

与其他蛋白类药物（如胰岛素 、白蛋白） 的冷冻干燥研究相比，本研究进一步强 调了工艺参数优化对IFN-α这一敏感蛋白药物的重要性 。由于 IFN-α分子较小且

表面电荷分布不均，其在冷冻干燥过程中更容易受到冷冻应力的影响。

综合来看 ，最佳冷冻干燥工艺包括使用蔗糖与海藻糖的 2:1 保护剂组合 ，快速预 冻（-80℃)  及-30℃升华条件。在这一条件下，IFN-α的残余活性超过 94%，聚集 水平最低，二级结构和化学稳定性均得到了显著改善。这一研究结果为冷冻干燥 工艺的优化提供了系统的理论依据，并对蛋白类药物的工业化开发具有重要的实 际意义。

结论

通过对重组人干扰素α（IFN-α)  冷冻干燥工艺的优化研究，本研究系统探讨了保  护剂配方 、预冻速率和升华温度对蛋白质稳定性的影响，并确定了最佳工艺条件。 在保护剂配方方面 ，蔗糖与海藻糖按 2:1 比例的组合显著提高了IFN-α的残余活  性和二级结构完整性，表明两者之间具有协同保护作用 。在预冻阶段，快速预冻  （-80℃)  通过形成均匀分布的微小冰晶有效减少了冷冻应力的影响 ，显著降低  了蛋白质的降解与聚集风险 。在升华阶段 ，较低的升华温度（-30℃)  有效减缓  了化学降解反应并提高了玻璃化转变温度，进一步确保了蛋白质的物理稳定性和  化学完整性。

优化后的冷冻干燥工艺条件下 ，IFN-α的残余活性保持在 94%以上 ，降解产物比 例最低，聚集水平显著降低，二级结构中的α螺旋和β折叠含量与新鲜样品几乎无 差异 。

研究结果不仅为IFN-α制剂开发提供了全面的技术支持，也为其他蛋白类药物的 冷冻干燥工艺优化提供了重要参考。未来的研究可以进一步探索不同保护剂组合 的协同效应及其在其他复杂蛋白分子中的适用性， 同时结合新型冷冻干燥技术 （如动态升华干燥） 以进一步提高蛋白类药物的稳定性和可工业化应用潜力 。

参考文献

[1] Vidal P. Interferon  α  in  cancer immunoediting: From  elimination to  escape[J]. Scandinavian Journal of Immunology, 2020, 91(5): e12863.

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[4]    Mehta    S,    Mukherjee     S,    Balasubramanian    D,     et    al.    Evaluation     of neuroimmunomodulatory    activity     of     recombinant     human    interferon     α[J]. Neuroimmunomodulation, 2014, 21(5): 250-256.

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