精液常规参数与精子DNA碎片指数的相关性研究

摘要：目的 探讨精液常规参数与中国男性不育患者中精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）的相关性。方法 选取2024年1月至6月广州市妇女儿童医疗中心柳州医院生殖医学中心诊治的1234例男性患者作为研究对象，依据WHO第六版精液检查参考标准对精液常规中部分项目进行分组，计算分组后的精子DIF水平，并进行多重线性回归分析。结果 分组项目精子浓度（Z=-4.34，,P<0.001）、前向运动精子百分率PR（Z=-15.51，,P<0.001）、精液体积（H=12.90，,P=0.002）、精子正常形态率（H=73.04，,P<0.001）的患者DFI差异有统计学意义。另外，不宜分组的年龄、禁欲天数、头部异常百分率、中段异常百分率、尾部异常百分率、过量残留胞质ERC百分率与患者DFI都呈正相关（P<0.001）。DFI的多重线性回归发现只有年龄、精子浓度、禁欲天数、精液体积、尾部异常百分率是其重要影响因素。结论 根据现有证据表明：年龄越大、禁欲天数越久、精子浓度、精液体积和尾部异常百分率越高则患者DFI越高，而PR越高则患者DFI越低。与正常形态精子百分率相比，精子尾部畸形率对DFI的影响更为重要。

关键词：精液常规；精子DNA碎片指数；过量残留胞质；精子畸形

男性不育症已成为全球范围内普遍关注的公共卫生议题，在男女共同因素导致的不孕育因素中，单纯男方因素占比约三分之一[1]。近年来的研究表明，精子DNA完整性的研究是近几年男性不育热点问题，精子DNA是重要的人类遗传物质载体，其完整性对于精卵结合、胚胎生长发育有重要影响，可以通过精子DNA碎片指数（DNA Fragmentation Index，DFI）评估其完整性。精子DNA检测是精液质量分析的有效辅助手段，它是评估精子功能的关键指标，其对精卵结合、胚胎植入、维持妊娠以及胎儿的健康成长至关重要[2]。显微镜下精子形态的评估，是传统男性生育力评估的重要手段，国内男科医生更多的关注于正常精子形态对于精子受精情况的分析，但精子形态其它部位的异常也是男性不育症的重要原因之一，包括头部、颈部、中段和尾部的各种畸形。例如精子尾部负责精子的运动和受精能力，其形态异常可能导致精子运动能力下降，从而影响生育能力[3]然而，精子形态中各部位畸形率对精子DNA完整性的影响尚未得到充分研究。本研究旨在研究精液常规参数与精子DNA完整性的相关性，特别是精子特定畸形部位是否会提示DNA碎片损伤，为男性不育症的治疗提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性选取 2024年1月至6月广州市妇女儿童医疗中心柳州医院生殖医学中心就诊的共1234例男性病例进行分析。纳入标准：男方精液标本采集完整未见遗漏；精液常规、精子形态与精子DFI检测同时申请检测；本项研究已通过医院伦理审查委员会的审批（批准文件编号：科研-2019-036），并已获得参与者的明确同意。

1.2 研究方法

1.2.1 精液样本收集 按WHO第六版标准[4]注意事项要求让患者手淫取精，在样本交接过程中，首先利用电子秤进行精确称量，然后将样本放置于设定在37℃的恒温培养箱中进行孵育，观察并登记精液液化时间。

1.2.2 精液常规检测 精液液化后，使用北昂BEION S3-2系统的全自动精液分析仪，对精子密度和前向运动精子（PR）等关键参数进行了详细分析。

1.2.3 精子形态检测 按照WHO第六版标准，使用华康生物有限公司生产的巴氏染色液，将质控形态涂片与样本同一批次染色，确保染色效果。并由检验人员使用多键细胞计数器在100倍油镜和10倍目镜下对染色后的精子进行计数和分类。严格按照Kruger标准评估精子形态，记录正常形态精子、各部位畸形（头部畸形、颈部及中段畸形、尾部畸形和过量残留胞质）精子个数，至少评估200个精子。

1.2.4 精子DFI检测 当天精液标本，使用美国BD FACSVia流式细胞仪按SCSA法用吖啶橙对精子细胞进行染色，该试剂由华康生物有限公司生产。每个样本采用中等流速计数10000个精子。正常精子由于DNA双链结构完整其荧光信号以530nm为主，而DNA异常精子由于存在单链片段而携带640nm荧光信号会偏离正常群体，最后统计异常精子占总精子的比例即为精子DFI。

1.2.5 分组 依据WHO第六版精液检查参考标准对部分项目进行分组，将精子浓度(×106/ml)分为≥15*106/ml组和<15*106/ml组；PR(%)分为≥32%组和<32%组；精液体积（ml）考虑到体积偏多也可能是异常，增加参考值95%分位点6.8ml为截点，分为三组即<1.5ml组、1.5-6.8ml组和≥6.8ml组；因部分生殖中心将精子正常形态率<2%作为严重畸形精子症判断标准，精子正常形态率(%)也分为三组：≥4%组、2%-4%组和<2%组。

1. 3 统计学处理

采用SPSS25.0软件进行统计分析，不符合正态分布的计量资料采用中位数[M（P25，P75）]来表示，方差不齐采用多个独立样的非参数（Kruskal-Wallis H）检验法对数据进行分析。 患者DFI与年龄、禁欲天数和精子各部位异常率采用Spearman相关性分析。对于单因素分析有意义的变量，采用多重线性回归模型分析患者DFI的独立影响因素，检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 患者的一般资料                   

总例数n=1234，其中患者平均年龄为36.0(32.0,39.0)岁；禁欲天数为4.0(3.0,5.0)天；头部异常百分率为90.24（87.80，92.16）%；尾部异常百分率为6.34（4.90，8.53）%；中段异常百分率为11.70（8.96，15.24）%；ERC百分率为2.94（2.32，4.39）%；其他特征详见表1。

2.2 单因素分析(见表2)

2.3 相关性分析(见表3)

患者DFI与年龄(r=0.200,P<0.001)、禁欲天数(r=0.163,P<0.001)、头部异常百分率(r=0.213,P<0.001)、中段异常百分率(r=0.208,P<0.001)、尾部异常百分率(r=0.336,

P<0.001)、ERC百分率(r=0.146,P<0.001)呈正相关。

2.4 多因素分析(见表4)

纳入年龄、禁欲天数和尾部异常百分率等因素构建多因素线性回归方程。进行多重线性回归分析，回归方程有统计学意义（R2=0.366，F=72.15，P＜0.001）。共有6个变量与患者DFI有关，提示年龄越大、禁欲天数越久、精子浓度、精液体积和尾部异常百分率越高则患者DFI越高；而PR(前向运动)越高则患者DFI越低。

3 讨论

在当今社会，男性不育患者逐年增加，除了传统的精子常规检查外，精子DFI检测受到越来越多男科医生的重视。有证据表明，男性不育及子代遗传变异与父系精子DNA损伤存在显著关联[5]，精子DNA损伤的机制可能涉及精子发生过程中的凋亡途径、在运输过程中受到氧自由基的影响[6]以及染色质组装异常等多个环节。此外，包括病理状态、环境暴露和个体生活方式在内的多种因素亦可能对精子DNA造成影响[7]。

多项研究表明，不育的男性患者DFI与精液常规中的多个参数存在相关联[7]，多数学者认为随着年龄增加，精子DFI增加。禁欲天数越久、精子浓度、精液体积越高则患者DFI越高，而PR(前向运动)越高则患者DFI越低[8]。本研究结果与前面学者实验结论一致。

正常的精子形态是实现受精的关键先决条件。马莉莉提出，精子的形态特征主要反映其外部特征，而DFI则指示精子核内遗传物质的完整性，两者之间的相关性尚需进一步研究以明确[9]。周雪等研究者发现，精子DFI与正常形态精子的比率呈现负相关性，暗示精子形态和DNA损伤之间可能存在相互作用[10]。本研究进行多重线性回归分析后发现，尾部异常百分率与DFI相关性更为显著，尾部异常百分率越高的患者其DFI越高。引起精子尾部畸形多为基因突变，现已发现DNAH1等30多个基因突变导致精子尾部鞭毛多发性形态异常[11]。此外，Marzieh Atshan研究表明，短尾精子患者的DNA 碎片和染色质堆积异常明显更高[12]。这种关系的一个可能的解释是，精子染色质浓缩和精子鞭毛形成发生在精子发生的同一阶段。Muratori等人研究表明，精子形态的异常可能与染色体异常、非整倍体现象以及DNA碎片化等因素相关联，形态畸形的精子染色体异常的发生率显著较高[13]。精子尾部异常与精子DNA碎片化水平的高比例相关联，揭示了两者之间可能的联系。然而，这一关联的具体作用机制仍需通过进一步的研究来阐明。

精子尾部畸形率对精子DNA完整性的影响提示我们，在治疗男性不育症时，应更加关注精子尾部形态异常。通过识别并解决潜在的原因，如改变生活方式、调整药物治疗或利用辅助生殖技术（如体外受精或胞浆内单精子注射），可能有助于提高受孕的可能性[14]。此外，针对精子尾部畸形的特异性治疗策略的研发也可能为不育症的治疗提供新的方向。

综上所述，精子尾部畸形率对中国男性不育患者中精子DNA完整性的影响显著，甚至可能比正常形态精子百分率更为重要。然而，本研究仍存在一些局限性，包括缺乏多中心样本数据，可能限制了结果的普适性，以及未能完全控制所有可能影响精子DNA完整性的混杂因素。未来的研究应进一步探讨精子尾部畸形率与精子DNA完整性之间的具体机制，同时考虑纳入更大样本量和更广泛的患者群体，以增强研究结果的可靠性和外推性。

参考文献：

 [1] Rosiak-Gill A, Gill K, Jakubik J, et al. Age-related changes in human sperm DNA integrity[J]. Aging (Albany NY), 2019,11(15):5399-5411.

 [2] Stavros S, Potiris A, Molopodi E, et al. Sperm DNA Fragmentation: Unraveling Its Imperative Impact on Male Infertility  Based on Recent Evidence[J]. Int J Mol Sci, 2024,25(18).

 [3] 商学军, 沙艳伟, 李琳, 等. 精子鞭毛多发形态异常诊疗专家共识[J]. 中华男科学杂志, 2021,27(10):948-953.

 [4] World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen.[M]. 6th ed. Geneva: WHO Press, 2021.

 [5] Hamilton T, Assumpcao M. Sperm DNA fragmentation: causes and identification[J]. Zygote, 2020,28(1):1-8.

 [6] 乔岩, 孙振高, 宋景艳, 等. 氧化应激致精子DNA碎片化异常相关机制的研究进展[J]. 中国性科学, 2019,28(03):44-47.

 [7] 李小玲, 肖卓妮. 精子DNA碎片率的影响因素及与常规体外受精早期胚胎发育的关系研究[J]. 中国性科学, 2024,33(08):4-10.

 [8] 徐岚, 胡泉, 黄丽丽. 男性精子DNA碎片率与年龄、精液参数的相关性研究[J]. 系统医学, 2023,8(13):19-21.

 [9] 马莉莉, 刘鹏. 不育症患者精子DNA碎片指数与精液参数关系分析[J]. 中国性科学, 2019,28(07):30-32.

[10] 周雪, 周艳芬, 孙国海, 等. 男性精子DNA碎片指数与精液常规参数的相关性研究[J]. 中国性科学, 2021,30(03):6-10.

[11] 倪小晴. 人类精子鞭毛多发形态异常的致病基因筛查及遗传学分析[D]. 安徽医科大学, 2020.

[12] Atshan M, Kakavand K, Hosseini S H, et al. Evaluation of sperm DNA fragmentation and chromatin structure in infertile men  with immotile short-tail sperm defect[J]. Andrologia, 2020,52(1):e13445.

[13] Muratori M, Piomboni P, Baldi E, et al. Functional and ultrastructural features of DNA-fragmented human sperm[J]. J Androl, 2000,21(6):903-912.

[14] 沈群山. 精子鞭毛异常男性不育的致病基因鉴定与机制研究及临床结局分析[D]. 安徽医科大学, 2022.

基金项目：广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题项目：精子过量残留胞质与辅助生殖技术临床结局的相关性研究（Z20190165）； 广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题项目：流式细胞术检测精子DNA碎片率的室内质量控制研究（Z20180038）。

作者简介：刘海儒（1985—），男，壮族，广西柳州，在职研究生，副主任技师，主要研究方向为生殖检验、医学检验。