基于数据挖掘及网络药理学探讨名中医杨小翠治疗 肾虚血瘀型骨质疏松症的组方规律及作用机制

摘要：目的 运用数据挖掘和网络药理学的研究方法，探究中药汤剂在肾虚血瘀型骨质疏松症（osteoporosis，OP）治疗中的组方规律和作用机制，为临床治疗提供参考。方法 以近1年来遵义市中医院名中医杨小翠治疗肾虚血瘀型骨质疏松症的中药处方为数据来源，采用中医传承计算平台对中药处方进行频次、关联规则、聚类分析，以揭示中药治疗肾虚血瘀型骨质疏松症的组成规律，并在此基础上采用网络药理学的研究方法，筛选核心靶点并通过KEGG通路和GO功能富集分析，研究高频药物与疾病的潜在作用靶点，阐明其作用机制。结果 共收集到67首处方，其中包含147味中药，补虚药、活血化瘀药应用较多；药物性味以甘温、甘平为主，归肝经、肾经、脾经较多；进一步关联分析得到高频药物组合11个；核心处方3个。应用网络药理学的研究方法，对核心药组“杜仲、当归、山茱萸、红花”的作用机制进行探索，发现其主要活性成分槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇等主要作用于AKT1、JUN、TNF、TP53、IL6等核心靶点，可能与IL-17信号通路、FoxO信号通路、钙信号通路、Ras信号通路等关键信号通路密切相关，以及细胞对活性氧的反应、对维生素D的反应等生物过程发挥治疗作用。结论 中药汤剂治疗肾虚血瘀型骨质疏松症（OP）常以标本兼治，补肾活血为法，临床疗效显著，研究发现高频药物可能是通过IL-17信号通路、FoxO信号通路等多条信号通路发挥治疗作用。

关键词：肾虚血瘀；骨质疏松；数据挖掘；中医传承计算平台；网络药理学；用药规律；作用机制

骨质疏松( osteoporosis，OP) 是以骨量减少、骨密度降低、易发生骨折为主要特征的全身性代谢性骨病[1]。在我们国家，50岁以下的患病率是15-50%，超过60岁的是56%[2]。随着人口老龄化的发展，骨质疏松越来越成为危害人民健康生活的健康问题。肾为先天之本，骨为肾之余，随着年龄的增长，人体肾气不断衰微，从而骨弱，因此临床诊疗中我们发现骨质疏松证型中以肾虚血瘀型居多，且中药内服汤剂对肾虚血瘀型骨质疏松症的疗效可观。因此，本研究拟以贵州遵义市中医医院名老中医杨小翠治疗肾虚血瘀型骨质疏松症的门诊处方为研究对象，以传统中医理论为基础，系统探讨其处方规律。在此基础上，采用网络药理学的研究手段，从疾病-靶点-通路三个层面系统地探讨该方的作用机制，为临床防治肾虚血瘀型骨质疏松提供科学依据，同时也为后续的基础研究提供借鉴。

1材料及方法

1.1 中医处方资料的数据挖掘

1.1.1资料来源

选取2021年07月-2022年07月期间就诊于遵义市中医院名中医杨小翠门诊的肾虚血瘀型OP医案。

1.1.2纳入标准

①西医诊断符合《中医药防治原发性骨质 疏松症专家共识(2020)》、中医诊断及证候诊断符合《中药新药临床研究指导原则》；②所选医案有完整药物、明确剂量；③多次就诊记录者，每次就诊均作为单独一则医案录入；④征得患者同意的医案。

1.1.3排除标准

①属于继发性骨质疏松症：包括I型糖尿病、甲亢、库欣综合征等代谢性疾病，或多发性骨髓瘤、肠吸收不良综合征、系统性红斑狼疮、白血病等全身疾病；②合并有严重心脑血管系统疾病，或肝肾功能异常者；③使用西药干涉治疗的病案；④诊断及证型不对应、药名及药量不清的处方。

1.1.4 药名规范

参照全国高等中医药院校规划教材《中药学》[3]对收集的处方进行规范整理。对于不同名称的同一种中药及药物炮制不同而名不同的中药。

1.1.5 数据的录入及核对 将规范整理后的中药处方按照平台要求的格式录入，录入过程中2人录入、1人审核，保证数据准确无误。

1.1.6 数据分析

将中医处方中的药物频次、功效、性味和归经进行统计分析，并对常用的药物组合、配伍规律、核心方药进行系统分析。 

1.2 基于网络药理学的核心药物的作用机制

1.2.1 核心中药的靶点及疾病靶点挖掘

从 TCMSP数据库中获取高频用药信息，获取中药药效物质基础。在 SwissADME数据库中对活性物质进行了筛选，筛选条件限制为：“GI absorption”为“High”，“Druglikeness”满足3个及3个以上。疾病相关靶点通过GeneCards数据库以“osteoporosis”为主题词检索得到，并进行标准化与去重处理，由此获得中药治疗骨质疏松症的潜在靶点。

 1.2.2“药物-靶点-疾病”网络构建及蛋白相互作用分析

通过在线作图工具Venny 2.0绘制韦恩图，获得活性成分与疾病共同靶点，通过 STRING 11.0在线数据库分析共同靶点（最高置信度参数值＞0.7）。

1.2.3 GO分析和 KEGG分析

运用DAVID数据库对获得的共同靶点进行GO功能（Gene Ontology，GO）及KEGG通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，分别获得相应的富集分析结果（P＜0.05）。

2 结果

2.1 处方数据挖掘

2.1.1 频数分析

药物频次统计利用 “药物频次”发现67首方剂共涉及147味中药。提取使用频次排名前20味的中药，分别为当归、黄芪、杜仲、甘草、熟地黄。见表 1。

表1 方剂中频次排名前20味的中药

2.1.2 药物性味分析 

通过药物四气五味的统计分析得出，药性以温性药使用频数最高，其次为平性、寒性；药味以甘味药的使用频数最高，其次为苦味、辛味。详见图 1、图 2。

图1  中药治疗肾虚血瘀型骨质疏松症的药物四气雷达图

图2 中药治疗肾虚血瘀型骨质疏松症的药物五味雷达图

2.1.3 药物归经分析

药物归经前4位依次为肝经、肾经、脾经、心经。详见图 3。

  图3 中药治疗肾虚血瘀型骨质疏松症的药物归经雷达图

2.1.4 药物功效分析

通过对药物功效的统计得出，治疗肾虚血瘀骨质疏松症的药物中补虚类药物频数最高，其次为活血化瘀、清热。详见图4。

        图4 中药治疗肾虚血瘀型骨质疏松症的药物功效柱状图

2.1.5 基于关联规则的组方规律分析

设置支持度为15，置信度为0.5，得出排名前10的药物组合，见表2，涉及中药8味。对所得到的药物组合进行关联分析，发现置信度＞0.7 规则10 条，见表3。 点击“网络展示”，得到关联规则网络展示图，发现当归、黄芪、杜仲、甘草、熟地黄、骨碎补、丹参、川芎在方剂中多次出现。见图5。

表 2 中药处方中出现频次排名前10的药物组合（次）

图5  关联规则网络展示图

表 3 药物组合关联规则

2.1.6 基于熵聚类的组方规律分析

设置聚类个数为“3”个，应用后台运用无监督的熵层次聚类算法进行聚类，即将67条数据分为3类，类似于3个核心类方，点击“核心组合”并导出。得到 3个潜在新处方，见表4。

表4基于聚类的新处方

2.2 核心药物的作用机制

2.2.1 核心中药的活性成分及靶点

通过数据挖掘，我们发现当归、杜仲、红花和山茱萸是治疗骨质疏松的高频用药，并出现在3个核心药对中。共获得39种有效成分，规范化和去重化处理后共得到255个靶标。输入 Cytoscape3.7.1软件，进行数值计算，选出12种在数值上排名靠前的12种有效成份，如表5所示。

表 5 中药治疗骨质疏松症的高频药物活性成分

2.2 共同靶点及可视化网络图

经GeneCards 数据库查询骨质疏松症相关靶点共得4381个。通过 Venny2.0得到活性成分与疾病共有靶点94个，并构建成分-靶点-疾病的可视化网络图，详见图 7、图 8。

图 7 骨质疏松症与药物活性成分共同靶点的韦恩图

图 8 高频药物活性成分-疾病靶点靶点网络图

2.2.3 蛋白互作网络分析

将共有靶点上传至STRING 11.0获取相应蛋白相互作用信息，涉及到94个节点和576条边，见图9。利用CytoNCA插件筛选核心靶点5个，详见图10。

图 9 蛋白相互作用网络图

图 10 核心靶点筛选过程图

2.2.4 GO分析及KEGG分析

运用DAVID数据库分析，得到GO功能富集条108条,涉及生物过程831条，包括细胞凋亡过程的负调控、细胞对活性氧的反应、对维生素D的反应等；细胞组分92条，包括质膜、细胞质、线粒体、突触前膜等；分子功能158条，包括蛋白激酶结合、类固醇结合、蛋白酶结合、细胞因子活性等。筛选得到KEGG通路179条，涉及IL-17信号通路、FoxO信号通路、钙信号通路、Ras信号通路关键信号通路。应用微生信平台分别取前10条绘制气泡图，见图11、12。

图11 高频中药治疗骨质疏松症关键靶点 GO 分析

图12 高频中药治疗骨质疏松症靶点 KEGG 富集分析

3 讨论

骨质疏松是一种常见的疾病，其发病机理非常复杂，与年龄、性别、遗传和药物等因素有关[4]，目前还没有根治的方法，尤其是在老年和绝经妇女中[5]。祖国医学将其归属于“骨痿”、“骨枯”等范畴，主要病机为肾气虚损，与瘀血、外邪等致病因素密切相关。本课题拟采用数据挖掘方法，对杨小翠院长治疗肾虚血瘀证的中医药规律进行研究，经数据挖掘，得到3个“补肝肾，益气，活血化瘀”的核心方剂，符合中医药对骨质疏松发病机制的认知。经分析，得到了杜仲、当归、山茱萸和红花四味中药组成的核心方剂。杜仲是《神农本草经》中的上品，“主腰背疼痛，补中益精，强筋骨……”，其味甘温中，有补肝肾，益肝阴，润肝燥，肾阴阳并补，常被用于平补肝肾。当归擅于补血，《本草择要纲目》云:“入手少阴，以其心生血也；入足太阴，以其脾裹血也；入足厥阴，以其肝藏血也。”当归补血，精血互生，亦可益精，肝肾之精充沛，则骨骼强健。山茱萸温而不燥、补而不腻，在补肾益精同时又能温肾助阳，阴阳俱补，是为补益肝肾之要药。红花辛散温通，“色红入血”，为通瘀活血之要剂。久病入络，虚则致瘀，骨质疏松多为虚瘀之证，故遣红花以畅通血脉，亦可防治补血瘀滞之弊。《伤科大成》中记载补肾活血汤，其补肾强骨、活血化瘀，方中正好具备杜仲、当归、山茱萸、红花四药，正对肾虚血瘀之证，故选此进行进一步研究。

我们发现获取的高频药物活性成分中度值靠前的活性成分分别为槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇等，而关键活性成分主要作用于IL6、TNF、JUN、AKT1、TP53等核心靶点。研究发现，槲皮素可通过激活 LPS介导的破骨细胞凋亡，调控核因子-κ B信号通路，调控破骨细胞激活因子（BMP/Smad、 Wnt/β- catenin）信号通路，促进破骨细胞 OPG/RANKL/RANK信号通路的激活，促进骨形成[6-9]。山奈酚可通过调控 Wnt/β- catenin信号通路，调节 RANKL/RANK通路，维持骨内稳态，并对PI3K/Akt、 MAPK、 BMP/samd信号通路进行调控，从而达到防治骨质疏松症的目的[10-17]。β-谷甾醇通过激活β-catenin所介导的信号通路，有效促进细胞成骨分化，提高机体骨形成能力[18-20]。关键靶点中，IL-6、TNF-α均参与了炎性反应，而IL-6是调控（CD)4+ T细胞STAT3活化的重要因子，参与了软骨、骨的退变[21]。同时， MAPK还能增强炎性因子如IL-6、TNF-α的分泌，从而加速炎性反应及骨破坏[22]。此外，TNF-α还可通过活化NF-κ B，促进 RANKL介导的破骨细胞分化，促进骨吸收。JUN是调控破骨细胞分化的关键转录因子，可通过NF-κ B、 Jun氨基末端激酶、p38等信号通路调控破骨细胞分化[23]。Akt1是PI3K、PIP3的下游靶蛋白，可通过PI3K/Akt途径下调 ALP、 OCN及成骨细胞分化成熟[24]。p53是一种转录因子，它可能通过改变细胞凋亡和周期，促进炎症和肿瘤的发生，它的激活可通过MAPK的磷酸化实现。目前关于Akt1、p53在骨质疏松作用方面的研究还有待更加的深入。

GO功能分析结果得出，核心处方“杜仲-当归-山茱萸-红花”主要是通过质膜、细胞质、线粒体、突触前膜等结构，调控基因的表达、转录和细胞增殖、凋亡和衰老等过程，参与蛋白激酶结合、类固醇结合、蛋白酶结合、细胞因子活性等分子活动来改善骨质疏松。骨质疏松症表现为骨量减少、骨密度降低、易发生脆性骨折，通过调控成骨和破骨细胞的平衡和代谢，减轻炎症反应，平衡骨稳态，从而改善骨质疏松的程度。KEGG富集分析发现，该方可能是通过调控IL17、 FOXO等信号通路发挥抗骨质疏松症作用。IL17是一类由6种亚型组成的细胞因子。IL-17是辅助性 T细胞分泌的IL-17，受IL-23诱导，参与慢性炎症反应，是一种促炎症因子，可通过分泌多种细胞因子，影响骨代谢[25]。研究表明，IL-17过度表达可使破骨细胞分化因子水平升高，二者相互作用介导骨转化，影响骨质疏松病理生理过程[26]。FOXO是抗衰老药物及抗衰老药物研发的重要靶标[27]。FOXO蛋白是FOX超家族的一个亚家族，FOXO转录因子家族包括四个成员，即FOXO1、FOXO3、FOXO4、FOXO6。有研究表明[28]，FOXO1、FOXO3、FOXO6的消融会导致骨氧化应激和成骨细胞凋亡增加，成骨细胞数量减少，骨形成率和骨量减少。此外，Foxo3在成熟成骨细胞中的过表达会降低氧化应激和成骨细胞凋亡，增加成骨细胞数量，提高骨形成率。由此可推测出核心处方“杜仲-当归-山茱萸-红花”主要通过抑制炎症反应、抑制破骨细胞和减缓成骨细胞凋亡来减轻骨质疏松。

我院名中医杨小翠院长师从国医大师张大宁教授，本文系统总结出其治疗肾虚血瘀型骨质疏松症的用药规律，并对核心处方进行网络药理学研究，为临床用药提供了理论依据。但也有一些限制。首先，由于本研究中所用的处方资料来自医院门诊，所包含的病例数较少，因此研究结果难免会有偏差。其次，基于网络药理学的研究只是理论性的，在靶点收集和通路选择上也有一定的偏差和疏漏，因此只能作为一个初步的预测，需要在后续的动物试验中加以验证。另外，在前期工作中，我们也发现了一系列与骨质疏松症密切相关的信号通路，如脂类与动脉硬化、内分泌抵抗、肿瘤等，但其具体分子机理尚不清楚，是后续研究的切入点。

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[作者简介]何扬渺（1999-),女，汉族，在读硕士，研究方向：中医药防治肾病  E-mail:2823749240@qq.com

[通讯作者]孙尚萍（1971-)，女，汉族，本科，主任医师，研究方向：肾病防治E-mail:850159261@qq.com

中图分类号：R249.2/.7

课题项目: 遵义市科技计划项目[遵市科合HZ字（2022）435号]