荧光标志技术+PCR检验HPV感染的研究

【摘要】目的：研究荧光标志技术+聚合酶链式反应（PCR）检验人乳头瘤病毒（HPV）感染的应用价值。方法：选择我院收治的疑似高危型HPV感染患者190例，所有患者均给予实时荧光定量PCR检验，以病理组织学诊断作为金标准，对比实时荧光定量PCR检验在检测高危型HPV感染中的诊断效能。结果：实时荧光定量PCR检验的准确率、敏感性、特异性分别为93.68%、95.37%、93.75%。结论：对于疑似高危型HPV感染患者，应用实时荧光定量PCR检验具有较高的灵敏度，特异性和准确性。

【关键词】荧光标志技术；PCR检验；HPV感染

人乳头瘤病毒（HPV）作为一种以人为唯一宿主的DNA病毒，其感染在妇科医学领域构成了一类常见病症。有关研究显示，HPV在女性群体中的感染率超过60%。从临床筛查数据来分析，多数宫颈癌患者的诊断结果均呈现HPV阳性状态，这说明了HPV感染与宫颈癌发生及病情进展之间的直接因果联系[1]。目前存在15种高危型HPV与宫颈癌密切相关，而在我国，HPV16、18、58等被视为主要的高危病毒株。针对高危型HPV感染的早期识别与诊断，是宫颈癌预防策略中的关键基石。当前，分子生物学技术已成为HPV检测的主流手段，其中，第二代杂交俘获试验（HC-Ⅱ）作为近年来广泛应用的检测方法，展现了其技术成熟性与实用性。随着分子诊断技术的飞速进步，聚合酶链式反应（PCR）检测技术正逐步拓展其临床应用范围。实时荧光定量PCR技术，通过巧妙融合荧光标志技术与PCR扩增技术，展现出了在HPV-DNA检测中的卓越性能，为后续医疗提供了有力支持。因此，本研究分析了荧光标志技术+PCR检验HPV感染的应用价值，具体如下：

1对象和方法

1.1对象

选择我院在2023年1月—2023年12月期间，收治的190例（平均年龄34.21±8.53岁）疑似高危型HPV感染患者作为研究对象。所有患者均知晓并同意参与本研究。我院伦理委员会对本研究完全知情，并批准研究。

1.2方法

所有患者均给予实时荧光定量PCR检验。具体方法如下：①采集宫颈脱落细胞标本。利用扩阴器将宫颈口充分扩张，确保宫颈完全显露。在阴道内仔细擦拭以清除多余分泌物，之后轻柔地插入宫颈刷，并沿逆时针方向旋转4至5圈以收集细胞标本。完成采集后，将宫颈刷安全转移至含有保存液的洗脱管中，并对每位患者的样本进行序号和姓名的精确标注。随后，密封管盖并折断宫颈刷，仅保留含有细胞标本的刷头部分。②提取HPV-DNA。将处理好的标本转移至1.5ml微量离心管中，以13000转/分钟的转速离心10分钟，去除上清液。接着，加入50μl裂解液，充分混匀以悬浮沉淀物，在100℃条件下加热10分钟，再次以13000转/分钟离心10分钟，最终保留上清液。③进行PCR扩增反应。设置PCR程序，在50℃下预变性15分钟，随后升温至95℃维持10分钟以激活聚合酶。接着，进行40个循环的扩增，每个循环在55—95℃之间的温度梯度变化，以促进DNA链的分离与重新合成，其中模板DNA在95℃下解离为单链。④杂交与洗脱。将PCR扩增产物加入杂交缓冲液中，通过沸水浴处理10分钟使DNA变性。调整杂交仪至51℃，让变性的DNA与探针杂交1小时。杂交完成后，在51℃下进行洗脱处理，持续15分钟，以去除未结合的杂质。⑤显色反应与结果分析。在杂交产物中加入过氧化物酶（POD）进行孵育，随后进行POD洗涤以去除多余酶分子。配制显色液并加入，通过化学反应使杂交信号可视化。最后，根据显色结果对样本进行判读。

1.3 观察指标

以病理组织学诊断作为金标准，对比实时荧光定量PCR检验在检测高危型HPV感染中的诊断效能。

1.4统计学分析

本次研究的所有数据均纳入SPSS23.0软件中，将其进行比较分析，使用卡方和%来表示计数资料。若（P＜0.05）差异有统计学意义。

2结果

在疑似高危型HPV感染190例患者中，病理检查确认其中110例患者确实为高危型HPV感染。通过实时荧光定量PCR检验后确认其中108例患者确实高危型HPV感染，实时荧光定量PCR检验的准确率为93.68%，其准确率无显著性（P>0.05）。实时荧光定量PCR检验的敏感性、特异性为95.37%、93.75%。

3讨论

宫颈癌作为妇科领域内最为普遍的恶性肿瘤类型之一，其发病比例在女性生殖道恶性肿瘤中占据半数以上，构成了对女性健康不容忽视的重大威胁。据相关研究表示，近乎全部的宫颈癌病例中均可检测到HPV的存在，且随着病变严重性的递增，HPV的阳性检出率亦呈现上升趋势[2]。高危型HPV感染患者的宫颈癌转化风险较高，宫颈癌具有较长的隐匿期，但在此期间采取积极、高效的预防与干预措施，能够有效遏制病情进展。特别是在病变早期阶段实施HPV筛查，能够确保宫颈癌前病变患者获得及时且有效的治疗，进而提升疾病的整体治愈几率。相反，对于错过早期针对性治疗窗口的患者，其生存预后往往不容乐观，生存率可能仅维持在约20%的水平。因此，临床上对于高危型HPV感染患者的早期筛查与诊断显得尤为关键。

鉴于HPV病毒的独特性质，其无法直接通过动物模型模拟或实验室人工培养，因此，在临床实践中，针对高危型HPV感染检测，分子生物学手段与形态学观察方法成为了不可或缺的检测途径。实时荧光定量PCR检验作为一种创新的核酸定量分析方法，在DNA扩增进程中融入了荧光化学检测技术，实时监测PCR循环后产物的累积量。实时荧光定量PCR检验的核心机制在于将荧光素标记的Taqman探针与模板DNA结合，随后经历高温变性使DNA双链分离、低温复性促进探针与模板特异性结合、以及适温条件下DNA聚合酶催化下的延伸反应。在此过程中，与模板DNA完美配对的Taqman探针会被酶切作用断开，释放出的荧光素在特定波长光的激发下发出荧光。随着PCR循环次数的递增，目标基因片段的数量按指数级增长，相应的荧光信号强度也随之变化。通过实时监测并量化这种荧光信号的增强，可计算出循环阈值，并进一步借助一系列已知模板浓度的标准品作为参照，精确计算出待测样本中目标基因的拷贝数，从而实现精准定量分析[3]。本研究结果显示，实时荧光定量PCR检验的准确率、敏感性、特异性分别为93.68%、95.37%、93.75%，这说明实时荧光定量PCR检验在疑似高危型HPV感染患者中的诊断具有较高的准确性和实用性。分析原因为实时荧光定量PCR检验中由于荧光探针的整合应用，且因每个PCR产物均伴随等量的荧光基团释放，极大地增强了DNA模板定量分析的精确度和特异性。此外，实时荧光定量PCR检验在检验过程中的微小差异被有效控制，确保了检验结果之间的高度一致性和良好的相关性，进一步提升了检验的可靠性和科学性[4]。

综上所述，对于疑似高危型HPV感染患者，应用实时荧光定量PCR检验具有较高的灵敏度，特异性和准确性，值得临床推广应用。

参考文献

[1] 杨林.高危型HPV基因分型PCR检测与宫颈病变的相关性[J].航空航天医学杂志,2022,33(02):181-184.

[2] 王瑞,陈咪咪.实时荧光PCR法在高危型HPV检测中的应用价值[J].临床医学研究与实践,2022,7(28):123-126.

[3] 应菲菲.实时PCR检验在高危型人乳头瘤病毒诊断中的价值分析[J].实用妇科内分泌电子杂志,2022,9(05):103-106.

[4] 姜赵华,肖勇武.荧光定量PCR检测女性HPV-DNA的临床价值[J].中国社区医师,2022,38(03):82-84.