游离泛素通过调控Bcl-2/Bax信号通路抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡

摘要：目的 探讨游离泛素对高糖环境下人肾小球系膜细胞（HMCs）凋亡的影响及其潜在机制。方法 体外培养HMCs，设正常糖组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）和高糖+游离泛素组（25 mmol/L葡萄糖+10、50、250 ng/mL游离泛素）。采用CCK-8法评估细胞活力，流式细胞术检测凋亡率，Western blot分析Bcl-2、Bax和caspase-3的表达水平。结果 与正常糖组相比，高糖组HMCs活力降低，凋亡率升高（P<0.05）;游离泛素干预可剂量依赖性地提高HMCs活力，降低凋亡率（P<0.05）。与正常糖组相比，高糖组Bcl-2蛋白表达下调，Bax和caspase-3蛋白表达上调（P<0.05）;游离泛素干预可剂量依赖性地上调Bcl-2表达，下调Bax和caspase-3表达（P<0.05）。结论 游离泛素可通过调控Bcl-2/Bax信号通路抑制高糖诱导的HMCs凋亡，为糖尿病肾病的治疗提供新的思路。

关键词：游离泛素；糖尿病肾病；肾小球系膜细胞；凋亡；Bcl-2/Bax

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）作为糖尿病最严重的微血管并发症之一，已成为终末期肾病的主要诱因^[1]。随着糖尿病患病率的不断上升，DN的发病率也呈逐年增加趋势。数据显示，约34.7%的2型糖尿病患者罹患DN^{[2, 3]}，使其成为仅次于各类肾小球肾炎的第二大终末期肾病原因^{[4, 5]}。因此，深入研究DN的发病机制并探索有效的预防和治疗策略具有重要的临床意义。

肾小球系膜细胞（mesangial cells，MCs）在DN发生发展中起关键作用，高糖环境可诱导MCs发生异常增殖、凋亡和细胞外基质沉积^[6]。泛素（ubiquitin，Ub）是一种广泛存在的小蛋白，在多种疾病状态下，游离泛素水平会出现显著升高^{[7, 8]}。然而，游离泛素在DN发病过程中的作用尚未明确。

本研究拟通过体外培养人肾小球系膜细胞（human mesangial cells，HMCs），观察游离泛素对高糖诱导的HMCs凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人肾小球系膜细胞（HMCs）购自美国ScienCell公司。

1.1.2 主要试剂

DMEM培养基（Gibco公司）;胎牛血清（Hyclone公司）;CCK-8试剂盒（Dojindo公司）;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（BD公司）;兔抗人Bcl-2、Bax、caspase-3和β-actin多克隆抗体（Cell Signaling Technology公司）;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（Jackson ImmunoResearch公司）;游离泛素（Sigma公司）。

1.1.3 主要仪器

CO2培养箱（Thermo公司）;倒置显微镜（Olympus公司）;流式细胞仪（BD公司）;凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

将HMCs用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞进行实验，分为以下4组:（1）正常糖组（5 mmol/L葡萄糖）;（2）高糖组（25 mmol/l葡萄糖）;（3）高糖+低浓度游离泛素组:25 mmol/L葡萄糖+10 ng/ml游离泛素;（4）高糖+中浓度游离泛素组:25 mmol/l葡萄糖+50 ng/ml游离泛素;（5）高糖+高浓度游离泛素组:25 mmol/l葡萄糖+250 ng/ml游离泛素。各组细胞培养24 h和48 h后进行后续实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力

将细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，按1.2.1节分组处理。培养24 h和48 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，37℃孵育2 h。酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD）值。细胞活力（%）计算公式:=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（正常对照组OD值-空白对照组OD值）×100%。

1.2.3 细胞凋亡检测

流式细胞术用于检测细胞凋亡率。将细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板，按1.2.1节分组处理。培养48 h后，收集细胞，PBS洗涤2次，重悬于100 μL结合缓冲液中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min。加入400 μL结合缓冲液，上机检测。以Annexin V-FITC+/PI-和Annexin V-FITC+/PI+细胞计为凋亡细胞。

1.2.4 蛋白表达分析

Western blot技术用于检测Bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白表达。处理48h后提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭后分别孵育相应一抗（Bcl-2、Bax、caspase-3和β-actin）。TBST洗涤后，孵育HRP标记的二抗。ECL显影后采集图像，以目的蛋白与β-actin的灰度比值表示相对蛋白表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x̄±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 游离泛素对高糖诱导的HMCs活力的影响

CCK-8结果显示（图1），与正常糖组相比，高糖组HMCs活力在24 h和48 h时点均显著降低（P<0.05）。与高糖组相比，游离泛素干预可剂量依赖性地提高HMCs活力，其中50 ng/mL和250 ng/mL游离泛素组在24 h和48 h时点均显著高于高糖组（P<0.05）。

图1 游离泛素对高糖诱导的HMCs活力的影响 (A) 24 h时点，(B) 48 h时点

2.2 游离泛素对高糖诱导的HMCs凋亡的影响

流式细胞术结果显示（图2），与正常糖组相比，高糖组HMCs凋亡率显著升高（P<0.05）。与高糖组相比，游离泛素干预可剂量依赖性地降低HMCs凋亡率，其中50 ng/ml和250 ng/ml游离泛素组凋亡率显著低于高糖组（P<0.05）。

图2 游离泛素对高糖诱导的HMCs凋亡的影响

2.3 游离泛素对高糖诱导的HMCs凋亡蛋白表达的影响

Western blot分析显示，与正常糖组相比，高糖处理显著降低了Bcl-2蛋白表达（图3），Bax和caspase-3蛋白表达显著上调（P<0.05）。与高糖组相比，游离泛素干预可剂量依赖性地上调Bcl-2蛋白表达(图3），下调Bax和caspase-3蛋白表达，其中50 ng/ml和250 ng/ml游离泛素组差异均有统计学意义（P<0.05）。

图3 游离泛素对高糖诱导的HMCs凋亡蛋白表达的影响

3 讨论

DN是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，其复杂的发病机制尚未完全阐明。肾小球系膜细胞（MCs）是构成肾小球的主要细胞之一，在维持肾小球结构和功能中发挥重要作用。高糖环境可诱导MCs发生异常增殖、凋亡和细胞外基质沉积，从而导致肾小球硬化，是DN发生发展的关键环节^[7]。因此，探讨高糖诱导的MCs凋亡机制及其干预策略，对阐明DN的发病机制和寻找新的治疗靶点具有重要意义。泛素（Ub）是一种广泛存在的小蛋白，是蛋白质降解的核心成分。近年来研究发现，除了存在于细胞内，在血清、脑脊液等体液中也存在着一定水平的游离泛素^[8]。在肝硬化、2型糖尿病、败血症等多种疾病状态下，游离泛素水平会出现显著升高^[9]。

本研究结果显示，高糖刺激可显著降低HMCs活力，提高凋亡率，这与既往研究结果一致^{[10, 11]}。游离泛素干预可剂量依赖性地提高高糖刺激的HMCs活力，降低凋亡率，提示游离泛素具有抑制高糖诱导的HMCs凋亡的作用。为进一步探讨游离泛素抑制高糖诱导的HMCs凋亡的分子机制，检测了Bcl-2/Bax信号通路相关蛋白的表达变化。Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的关键蛋白，Bcl-2具有抗凋亡作用，而Bax则促进细胞凋亡^[12]。Caspase-3作为凋亡执行者蛋白，其活化被认为是细胞凋亡的重要标志之一^[13]。本研究结果显示，高糖刺激可显著下调HMCs Bcl-2蛋白表达，上调Bax和caspase-3蛋白表达。游离泛素干预可剂量依赖性地上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax和caspase-3蛋白表达。

本研究报道了游离泛素对高糖诱导的HMCs凋亡的保护作用及其分子机制，为DN的防治提供了新的思路和实验依据。然而，本研究仍存在一些局限性：首先，本研究仅在体外细胞水平进行了探讨，尚需进一步在动物模型中验证游离泛素的作用；其次，游离泛素调控Bcl-2/Bax信号通路的具体分子机制有待进一步深入研究；再次，游离泛素是否还通过其他信号通路发挥作用尚不清楚。这些问题都需要在今后的研究中进一步阐明。

总之，本研究结果表明，游离泛素可通过调控Bcl-2/Bax信号通路抑制高糖诱导的HMCs凋亡。这一发现不仅有助于深入理解DN的发病机制，也为DN的防治提供了新的潜在靶点。未来的研究应进一步探讨游离泛素在DN动物模型中的作用，以及其他分子机制，为开发新的DN治疗策略奠定基础。

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