变性梯度凝胶电泳检测大学生患龋治疗前后口腔菌群多样性的初步研究

摘要;目的：借助 PCR-变性梯度凝胶电泳技术这一技术（DGGE）对大学生龋齿患者治疗前后口腔菌群的多样性变化展开探讨与分析。  方法：选取我院接收的25例大学生龋齿患者进行口腔检查，在龋齿治疗前和治疗后2周进行采样，并利用 PCR-DGGE 技术检测受试大学生唾液样本展开分析，探讨大学生患龋治疗前后口腔菌群多样性的变化。  结果：治疗前大学生患龋唾液样本DGGE 条带数为24.32±1.87，治疗后大学生唾液样本 DGGE 条带数为29.12±3.76，存在显著差异（p<0.05）；同一时间段内，大学生患龋治疗前后DGGE 图谱的相似性显著高于不同样本之间的差异，说明大学生口腔微生物多样性与其口腔健康存在一定的关系。  结论：利用PCR-DGGE 技术对大学生患龋治疗前后口腔菌群多样性进行监测与分析，可以有效地了解大学生口腔微生物群落组成的动态变化，并对口腔微生物多样性与龋齿的关系展开进一步分析与探讨。

关键词：PCR-DGGE；大学生；患龋治疗；口腔菌群；多样性

近些年来，关于龋相关的宿主行为因素研究愈加深入，但研究对象还是以儿童为主，针对大学生龋病病因的研究中，几乎没有围绕“微生物”展开分析。虽然，专家学者们普遍认为，人口口腔内的温度、湿度以及营养来源、结构的复杂性以及理化性质不同，导致不同人群、不同年龄段群体口腔内微生物组成存在一定的差异，但具体如何还没有准确的结论。不可否认的是，口腔微生物菌落中的多种微生物，如真菌、病毒、细菌等，与人类口腔组成了一个生态系统，共同维持着口腔生态平衡，对龋齿与口腔微生物群落的变化研究中，尚未完全揭示口腔微生物群落稳定与多样性和口腔疾病发生的内在联系，对于龋齿对口腔微生物群落多样性的影响，也还没有统一的定论。不过，对大学生龋齿治疗前后口腔微生物多样性展开研究，既可以更好地了解口腔微生物群落的结构与功能，进一步对大学生口腔疾病的发病机制与预防措施展开研讨，又可以为大学生口腔疾病治疗与预防提供新的思路，从而填补当前关于龋齿研究的空白。所以，本研究针对前来就诊的25名大学生龋齿患者展开调研活动，利用变性梯度凝胶电泳技术（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）就其治疗前、治疗后2周的口腔微生物群落进行检测，针对检测结果，进一步探讨龋齿的微生物诊断的依据、大学生龋齿的预防和治疗如何展开，具体研究过程如下。

1资料与方法

1.1 临床资料

本研究纳入了2023年4月～2024年1月间在我院就诊的大学生龋病患者25例，主要是患有龋病并在接受治疗的大学生。所有参与者需在研究开始前签署知情同意书，并接受口腔检查和口腔样本采集。纳入标准：年龄18-25岁，龋病诊断明确；认知正常，不合并其他口腔疾病；愿意接受治疗和样本采集。排除标准；患有其他口腔疾病，如牙周炎、口腔癌等；在过去的6个月内使用过抗生素或其他可能影响口腔菌群的药物；有任何影响口腔健康的全身性疾病。

1.2 研究方法

本研究采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术来检测口腔菌群多样性，主要是在大学生龋病治疗时、治疗后2周，进行口腔唾液样本采集。具体步骤如下：

（1）样本采集：使用无菌棉签从患者的口腔中采集唾液样本，并立即将其储存于-80°C的冰箱中，以保留菌群的活性。

（2）DNA提取：将唾液样本置于室温下解冻15min后，分别抽取100μL，利用柱离心式小量细菌基因组 DNA 抽提试剂盒（上海华舜生物技术有限公司）从唾液样本中提取总DNA。

（3）PCR扩增：使用 PCR Master Mix 和 DNA 聚合酶（含 10 × PCR 缓冲液），利用引物 HDA-1/2对总DNA进行PCR扩增，扩增 16S rDNA 的 V2-V3区，长度约280 bp，进而获得目标菌群的DNA片段。

（4）DGGE分析：选取变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌、乳杆菌和伴放线杆菌作为参考菌，通过引物扩增后，DGGE 标记条带位置，扩增产物混合，将每种细菌 DNA 浓度调整到 20 ng/μL，备用。然后，将PCR产物加载到变性梯度凝胶中，通过电泳分离DNA片段，并根据其序列差异显示不同的条带。

1.3 观察指标

本研究的主要观察指标有三，一是患龋病前后口腔菌群的多样性指数，如香农指数和辛普森指数；二是DGGE图谱上菌群的条带数量和种类；三是与治疗效果相关的菌群变化，如有益菌群和有害菌群的占比变化。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计分析。对于连续变量，使用t检验或Mann-Whitney U检验进行比较；对于分类变量，使用卡方检验或Fisher精确检验进行分析。所有统计测试均采用双侧检验，并设定显著性水平为0.05。

2结果

2.1受试大学生的患龋情况

在本研究中，共纳入25名大学生作为受试者。其中，男性15例，女性10例，年龄范围在19~24岁之间，年龄均值为22.34岁，患龋牙数在2~12之间，平均患龋牙数为6.,2，平均患龋牙面数10.2，经独立样本 t 检验，男女之间患龋牙数、患龋牙面数均无显著性差异（p>0.06)。所有受试者在研究期间均接受了龋病治疗，并在治疗后进行了口腔样本的再次采集。

2.2 样本中参考菌检出率分析

通过对采集的口腔样本进行变性梯度凝胶电泳分析，检测到了多种口腔菌群。在患龋病的学生样本中，大学生龋齿治疗前，参考菌在样本中检出例数及检出率，明显低于龋齿治疗后，差异显著（p<0.05），具体见表1；治疗前后大学生唾液样本 DGGE 指纹图谱见图 1，每一水平位置代表一种细菌的基因型。

图1大学生龋齿治疗前后唾液样本DGGE 指纹图谱

表1 参考菌在样本中检出例数及检出率

2.3 样本菌群多样性分析

治疗前大学生患龋唾液样本DGGE 条带数为24.32±1.87，治疗后大学生唾液样本 DGGE 条带数为29.12±3.76，存在显著差异（p<0.05）；菌群多样性分析结果显示，患龋病的学生口腔菌群多样性较低，香农指数和辛普森指数分别为2.33和2.54。而在经过治疗后，菌群多样性得到了一定程度的恢复，香农指数和辛普森指数分别上升至4.65和5.44。这表明治疗对于改善口腔菌群多样性具有积极作用。此外，通过DGGE图谱分析观察到患龋病学生样本中某些条带的数量和强度较高，这些条带可能代表了与龋病发生相关的优势菌群。而在治疗后采集的样本中，这些条带的数量和强度有所降低，同时出现了一些新的条带，这可能意味着菌群的重新平衡和有益菌群的增多。总的来说，经过治疗后，菌群多样性得到了恢复，并且参考菌的检出率有所下降。这些结果为龋病的预防和治疗提供了新的视角和思路。

3讨论

龋病是口腔中最常见的疾病之一，该病会破坏牙齿的硬组织，导致牙齿出现龋洞、松动、脱落等症状，不仅影响口腔的整体健康，还会影响患者的咀嚼、发音等功能。大学生是一个特殊的社会群体，其生活和学习环境相对独立，口腔卫生习惯和自我保健意识相对较低，造成大学生群体中龋病的发病率相对较高。可能与大学生的生活习惯相关，如熬夜、饮食不规律、缺乏运动等不良生活习惯都可能导致口腔环境失衡，增加龋病的发生风险，再者过多摄入高糖、高脂、高盐等不健康食品，以及缺乏膳食纤维等有益营养素的摄入，也会对口腔健康造成不良影响。由于，龋病对大学生群体的危害较大，而大学生的生活习惯、饮食习惯、口腔卫生意识以及学习压力与作息等因素都可能导致龋病的发生。因此，探究大学生患龋治疗前后口腔菌群多样性，对该病防治极为重要。

现阶段，关于龋齿发生有关的细菌属于口腔内的常驻细菌，龋病的发病机制以及相关细菌所起到的作用等，还不被人们所认知，有些学者认为，龋齿可能是因为口腔内牙菌斑微生态失衡，造成口腔内微生物菌落从健康状态转变致病状态；有些学者则认为，由于口腔内存在着数百种微生物，而有部分细菌还无法通过以往的纯培养方式来获得，龋齿的发生可能与这些细菌有关。所以，龋齿患者发病前后口腔内微生物群落组成结构与变化，在防治口腔疾病方面有着极其重要的意义。然而，现阶段的大部分研究，多是针对学龄前儿童龋齿的研究，针对大学生龋齿人群的调查研究很多，当前关于龋齿微生物群落的研究结果是否具有普适性还不确定，针对大学生患龋治疗前后口腔菌群多样性展开研究，具有极其重要的意义。本研究利用变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）这一新兴的分子生物学技术，对大学生龋病治疗前后口腔内微生物群落多样性的变化展开检测与分析，探讨环境微生物多样性和群落动态性等，力求对大学生龋病的微生物诊断以及预防和治疗提供借鉴与参考。

利用变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）对大学生患龋治疗前后口腔菌群多样性展开研究，主要是该疾病具有以下优势：首先，变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）在龋齿患者治疗前后口腔菌群多样性研究中，凭借其可靠性强、重现性高和方便快捷等优点，能够为研究开展提供有力的工具，如DGGE技术可以较为真实地反映口腔中微生物的分布和组成情况，从而深入了解龋齿发生和发展的微生物学机制，或是在龋齿患者的治疗过程中，DGGE技术可用于监测治疗效果以及评估治疗效果，评估口腔菌群多样性的变化，以及预测疾病的复发风险。其次，DGGE技术通过核酸信息对微生物群落进行表征，较传统的菌种分离培养技术更快捷并能鉴定出不可培养细菌，能够在不培养细菌的情况下直接检测口腔中的微生物，避免了传统方法中的一些限制和偏见； DGGE技术在凝胶中建立一定的变性梯度，使长度相同但碱基组成不同的PCR产物在不同的变性剂浓度处解链，从而改变迁移速度，所以不同的序列的微生物DNA片段可以被分离开，形成条带各异的电泳图谱，就算是单个碱基的差异也可以造成迁移速度的改变，所以借助DGGE技术具有高分辨率和高灵敏度，能够检测到微小的序列差异，明确大学生龋齿治疗前后口腔微生物组成结构与变化。

本研究结果显示，大学生患龋病前口腔菌群多样性较低，治疗后2周，口腔菌群多样性得到明显恢复。这一发现，与现有研究结果相似。黄岩，王明丽（2023）就提出，某些菌群与龋病的发生发展密切相关，这些菌群在患龋病前的口腔中占比较高，而在治疗后则显著降低。通过调节这些菌群的占比，可能有助于预防和治疗龋病。麻世英，董岩，尚佳健（2023）强调，通过对DGGE图谱的序列分析，发现某些与龋病发生密切相关的菌群在治疗前占比较高，治疗后则显著降低；而一些有益菌群的占比则有所增加。所以，本研究结果，为深入理解龋病的发病机制提供了新的视角，也为优化龋病预防和治疗策略提供了依据：探索与龋病发生发展相关的特定菌群及其功能，以及通过调节菌群结构来预防和治疗龋病。

综上所述：通过采集大学生患龋病前和经过治疗的口腔样本，并进行DGGE分析发现，口腔菌群多样性在治疗前后存在显著差异，说明大学生患龋病前口腔菌群多样性较低，而治疗后多样性得到明显恢复，未来可以进一步尝试将DGGE技术与其他分子生物学技术相结合，以更全面地了解口腔微生物群落的生态平衡和调控机制。

参考文献：

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[5]黄岩,王明丽. 儿童口腔微生物多样性与龋齿的关系 [J]. 家庭生活指南, 2023, 39 (06): 35-37.

[6]麻世英,董岩,尚佳健. 低龄儿童龋病相关口腔菌群动态变化的研究进展 [J]. 北京口腔医学, 2023, 31 (02): 142-145.

文章加上课题:项目名称：肇庆市2021年度科技创新指导类项目(编号:2021040312016)