猫眼草提取物对裸鼠胃癌增殖的影响及与COX-2关系的研究

[摘要] 目的 观察猫眼草提取物对裸鼠胃癌增殖的影响，并初步探讨与COX-2的关系。方法  构建BGC-823细胞裸鼠原位移植瘤模型，随机将裸鼠分为模型组、猫眼草低剂量组（20g/kg/d）、猫眼草中剂量组（40g/kg/d）、猫眼草大剂量组（80g/kg/d），末次给药后第二天麻醉小鼠后颈椎脱臼处死，迅速取出完整移植瘤，测量其最长径（a）和最短径（b），计算肿瘤体积（V＝a×b2/2），称量瘤重；用RT-PCR方法测定COX-2mRNA的表达，用免疫组织化学及免疫印迹方法测定COX-2的表达水平。结果  猫眼草低剂量组的抑瘤效果为29.27%，中剂量组为47.56%，高剂量组为67.07%，高剂量组抑瘤效果显著提高（P<0.05）。通过免疫组化染色，我们发现：猫眼草水煎液诱导的小鼠荷瘤模型中COX-2的表达显著降低；qRT-PCR检测显示猫眼草各组移植瘤COX-2 mRNA的表达明显下调。结论,猫眼草提取物可呈剂量依赖性抑制BGC-823细胞裸鼠移植瘤的生长，与模型组比较，猫眼草各剂量组均有一定抑瘤效果，肿瘤体积、肿瘤质量均显著减小，其机制可能与抑制COX-2的表达有关。

[关键词] 猫眼草提取物；BGC-823移植瘤；COX-2

胃癌是一种严重危害人类健康的常见疾病，是一个全球性的健康问题。胃癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一[1]。我国胃癌发病率居消化道恶性肿瘤之首。因此对胃癌防治的研究刻不容缓。随着医学的不断发展，人类对胃癌的研究已日益深入，但胃癌发病机制复杂，临床上至今尚无令人满意的防治策略，其治疗仍以手术、化疗和放疗为主。而放、化疗费用昂贵，多数病人无力负担，且有其局限性和明显的毒副作用。近年来，中医药在胃癌治疗领域的研究成果显著。一系列相关研究表明，中药在肿瘤的多层次、多位点、整体调控等方面具有明显优势。因此探寻有效的抗胃癌中药，并探讨其作用机制，对于胃癌的防治有非常重要的意义。

基于这种考虑，结合我们的前期工作基础，本项目主要从研究猫眼草提取物抗胃癌作用及与肿瘤相关蛋白COX-2表达的关系的角度入手，对猫眼草抗胃癌作用机制进行研究，阐明猫眼草抗胃癌的作用靶点，为了进一步探究胃癌的发生发展机制，为胃癌的预防和治疗提供理论依据。

1  材料和方法

1.1 动物实验：从北京维通利华动物试验科技有限公司购得4-6周龄的雄性BALB/C裸鼠，生产许可证号码：SYXK（京）2022-0052，在山东第二医科大学动物实验研究平台进行SPF级动物实验。

1.2药物制备：从北京同仁堂大药房（潍坊）购得猫眼草生草，批号220823。猫眼草提取物的制备：将100g的猫眼草加入1000 mL的水中，煎煮20分钟2次，然后用4个薄纱将其滤出，然后将其浓缩到50ml，得到2g/ml的生药溶液，然后在高温下进行高温灭菌，保存在4℃的冷藏箱中，备用。

 1.3 模型制备及分组 BGC-823细胞购自中国科学院上海细胞库。将冻存的 BGC-823细胞解冻、复苏,接种于体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素双抗的的杜氏PBS缓冲液改良Eagle培养基中,置于37℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中,待其贴壁后,采集对数生长周期的细胞，调节其浓度至1×107/mL，培养基中培养。在裸鼠右腋下皮下种植0.2毫升的肿瘤细胞悬浮液。实验动物20例，根据随机分组方法，分为4组，每组各5只。模型组：生理盐水0.4 mL；猫眼草低剂量组：20g/kg（0.2ml）；猫眼草中剂量组：40g/kg（0.4ml）；猫眼草高剂量组：80 g/kg（0.8ml），每日灌胃1次，连续给药两周。实验过程中，各组裸鼠进食正常。

1.4观察指标

1.4.1 肿瘤体积及质量：末次给药后第二天用1%戊巴比妥钠（50mg/KG腹腔注射）麻醉小鼠后颈椎脱臼处死，迅速取出完整移植瘤，测量其最长径（a）和最短径（b），计算肿瘤体积（V＝a×b2/2），称量瘤重，计算各组的肿瘤抑制率，肿瘤抑制率＝(模型组移植瘤平均质量－药物组移植瘤平均质量)/模型组移植瘤平均质量×100%。

1.4.2 免疫组化检查肿瘤组织中COX-2的表达：4%甲醛固定肿瘤组织，石蜡包埋，5μm连续切片后根据说明书染色。将I抗体按1:500稀释后，用DAB显色，进一步使用苏木素进行复染，然后封片、拍照。

1.4.3 取肿瘤组织，低温充分研磨，提取总蛋白，Western blot法检测COX-2基因的表达检测及总蛋白的提取，用Bradford方法检测蛋白的浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后进行转膜、封闭液封闭1小时，一抗4℃过夜，TBST漂洗3遍，二抗孵育约1h，ECL发光分析。

1.4.4 取肿瘤组织，低温充分研磨，提取总RNA，qRT-PCR法检测COX-2 mRNA的表达 Trizol法迅速提取RNA，使用TaKaRaRT逆转录试剂盒进行逆转录，合成cDNA，95℃预变性，聚合酶链反应：95℃、5 S、60℃、30 S，循环40次；COX -2上游引物：5’- GATGATTGCCCGACTCCCTT-3’, 下游引物：5’-GAAAAGGCGCAGTTTACGCT -3’。β-actin为内参。

1.5 统计学分析  所得数据使用SPSS18.0统计软件分析。计量资料以（`x±s ）表示，方差分析（ANOVA）进行统计学检验。P<0.05为有显著性差异。

2  结果

2.1  各组裸鼠移植瘤比较：与模型组比较，猫眼草各剂量组均有一定抑瘤效果，肿瘤体积、肿瘤质量均显著减小；与猫眼草中剂量组比较，猫眼草低剂量组、高剂量组均有显著差异（见表1）。

注：与模型组比较：*P＜0.05；与中剂量组比较：#P＜0.05

2.2  各组裸鼠移植瘤COX-2蛋白的表达：免疫组化、western blot结果显示，猫眼草各剂量组COX-2表达均低于模型组；与猫眼草中剂量组比较，猫眼草低剂量组、高剂量组COX-2的表达均有显著差异（见图1、2）。

图1 免疫组化检测各组裸鼠移植瘤COX-2蛋白的表达（×100）

注：与模型组比较：*P＜0.05；与中剂量组比较：#P＜0.05

图2 western blot检测各组裸鼠移植瘤COX-2蛋白的表达

注：与模型组比较：*P＜0.05；与中剂量组比较：#P＜0.05

2.3  各组裸鼠移植瘤中COX-2 mRNA的表达：qRT-PCR结果显示，猫眼草各剂量组COX-2 mRNA的表达均低于模型组（P＜0.05），而高剂量组下调最明显（P＜0.05，见图3），这与蛋白表达的结果相一致。

图3 qRT-PCR检测各组裸鼠移植瘤COX-2mRNA的表达

注：与模型组比较：*P＜0.05；与中剂量组比较：#P＜0.05

3  讨论

环氧合酶-2 （COX-2）是近年被证实与肿瘤发生、发展及预后密切相关的一项重要调控因子。环氧合酶-2 （COX-2）是由花生四烯酸转化为 PGS的关键酶，其异构体（COX-1）和COX-2 （COX-2）在消化道肿瘤中发挥重要作用。COX-2在多种组织中不表达或表达很少，但在多种因素的作用下会快速升高，并且与疼痛、炎症和肿瘤等疾病的发生发展有着紧密的联系[11]。我们团队前期研究发现，Hp感染上调胃癌组织中COX-2的表达，以上结果表明，环氧合酶-2在胃癌早期发病过程中起着重要作用。经免疫组化及RT-PCR证实，大肠癌及胃癌中COX-2的表达明显高于对应的正常组织。前期研究表明，非甾体类抗肿瘤药物（NSAIDS）可显著减少食管癌、胃癌等疾病的发生，在阿司匹林治疗的结直肠癌（CRC）中，其死亡率减少了40%-50%，其机制与抑制COX-2的高表达有关。本课题组前期利用反义核苷酸筛选出了COX-2的反义核苷酸位点，并利用反义核酸对其进行了初步的体外实验，结果显示：COX-2的反义核苷酸能够显著地抑制胃癌的生长，从而在动物模型中实现对COX-2的靶向调控，从而实现对胃肠肿瘤的防治。研发安全高效的COX-2抑制剂或联合调节致癌基因的药物，将为胃癌的防治提供新的思路。我们的研究通过免疫组化、western blot结果显示，猫眼草各剂量组COX-2的表达均低于模型组；与猫眼草中剂量组比较，猫眼草低剂量组、高剂量组COX-2的表达均有显著差异，qRT-PCR结果显示，猫眼草各剂量组COX-2 mRNA的表达均低于模型组，而高剂量组下调最明显，与蛋白表达的结果相一致。由此可见，猫眼草能够显著下调人胃癌裸鼠成瘤组织中COX-2和mRNA的表达，提示其具有抗肿瘤作用。

综上所述，本研究以COX-2为切入点研究猫眼草抗胃癌的作用机理，首次研究了猫眼草抗胃癌作用及其作用靶点和机制，为猫眼草提取物在抗胃癌的临床应用上提供了一定的理论依据，为中医药治疗癌症及创新药物研发奠定理论基础。本研究仍有许多不足之处，包括对猫眼草提取物调控COX-2表达的信号通路尚不清楚，其可能的调控途径，是否通过PPARγ的激活及NF-B信号转导，下调COX-2的表达，进而影响肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为，发挥抗胃癌的作用及分子机制，均有待进一步运用分子生物学技术予以阐明。 

［参考文献］

[1]Zheng RS,Zhang SW,Zeng HM,et al.Cancer incidence and mortality in China, 2016[J].J Natl Cancer Cent,2022,2(1):1-9.

[2]关炜然,魏俊花,朱月存,等. 抗肿瘤药物研究进展[J]. 中国保健营养,2021,31(28):38.

[3]张舒婷,吴凡伟. 中药猫眼草抗癌活性成分研究[J]. 中医药导报,2021,27(9):82-85.

[4]张彦,白思雨,马建梅,等. 猫眼草中科罗索酸对肝癌SMMC-7721细胞作用的研究[J]. 世界科学技术-中医药现代化,2022,24(9):3524-3531.

[5]黄良江. 藏药猫眼草化学成分基础研究及黄酮化合物含量的高效液相色谱分析[J]. 中国民族医药杂志,2022,28(11):54-58.

[6]李鑫,王可轩,李东辉,等. 青蒿素工业提取废料丙酮层中猫眼草黄素等3种多甲氧基黄酮富集研究[J]. 天然产物研究与开发,2019,31(11):2001-2006.

[7]赵雪松. P--gp抑制剂猫眼草黄素调控青蒿素抗性疟原虫血红素代谢异常及其机制研究[D]. 江苏:扬州大学,2022.

[8]王亚萍,陈锴,惠起源. 中草药猫眼草提取物诱导人胃癌细胞凋亡可能分子机制的探讨[J]. 现代肿瘤医学,2015,23(8):1169-1171.

[9]姜奎,王秀杰,刘江月等.猫眼草提取物对胃癌细胞增殖的影响及其机制探讨[J].中国临床实用医学,2010,4(8):18-19.

[10]刘江月,李香玲,刘同美等.猫眼草提取物对人胃癌细胞BCG-823的实验研究[J].潍坊医学院学报,2010,32(6):437-438.

[11]YE YAO, WANG XIPENG, JESCHKE UDO, et al. COX-2-PGE2-EPs in gynecological cancers[J]. Archives of Gynecology and Obstetrics,2020,301(6):1365-1375. 

基金项目：2023年潍坊市中医药科研立项项目（WFZYY2023-1-003） 

通讯作者：陈彦防 ，女，主治医师.