利用转基因植物生产药用蛋白的研究进展及应用现状

摘要：转基因植物已成为生产重组药用蛋白的新趋势，具有操作简单、成本低、生产周期短、大规模应用前景广阔等优势。目前，转基因植物生物反应器研究领域已经取得多项成果与突破，部分产品已获批上市，实现商业化生产。本文综述了转基因植物作为生物反应器生产重组蛋白的研究进展及应用现状，介绍了转基因植物生物反应器类型、表达系统及机制、提高药用蛋白表达效率的策略，并对其研究及应用前景进行展望。

关键词：转基因 ；植物生物反应器 ；药用蛋白 ；表达系统  ；研究进展

抗体、酶制剂等药用蛋白作为生物制药的重要组成部分，可用于治疗癌症、糖尿病、自身免疫疾病等一系列疾病，具有广泛的临床应用价值。由于天然来源的药用蛋白提纯流程工艺复杂，无法满足市场需求，而传统的药用蛋白生产基于生物反应器（微生物和细胞系统），技术难度大，可能存在安全隐患，因此需要开发更理想的药用蛋白生产方式。伴随蛋白提取和纯化技术以及转基因技术逐渐完善，植物生物反应器与生物和哺乳动物细胞生物反应器的产量不再呈现数量级差异[1]，利用植物生物反应器生产高附加值的生物产品逐渐被认识与接受，具有不可替代的优势[2]，基于植物生物反应器生产具有医药用途的功能性蛋白，如人或动物用抗体和重要的氨基酸等成为主流方向之一。本文将深入分析既往利用转基因植物生物反应器生产药用蛋白的研究及临床应用情况，讨论不同类型植物反应器具有的优势及存在的问题，旨在为新型植物生物反应器生产药用蛋白深入研究提供参考。

1  转基因植物生物反应器类型及表达系统

1.1表达宿主  宿主是对生产外源蛋白的关键。选择宿主需匹配考虑外源蛋白特性、转化和再生能力、翻译后修饰、规模化生产能力、运营维护成本、生产周期及下游加工要求等多种因素。如何选择适合的植物宿主和基因表达改造及如何提高表达效率，提高质量和产量是转基因植物生产药用蛋白的关键。

1.1.1 烟草  烟草是较早开始研究的转基因多叶植物，是理想的植物生物反应器宿主，可终年生长获取，常作为研发疫苗等外源蛋白表达的模式植物载体。烟草瞬时表达模式在制备分子医药中，如医用蛋白、药物合成等，得到广泛应用[3]，其方法为利用农杆菌通过注射渗透的方法，将外源基因导入烟草叶片，实现转基因“叶片”，从而提取外源药物蛋白或化合物。通过烟草瞬时表达了长春花来源的8个基因，高效合成了长春碱化合物，丰富了此类抗肿瘤用药来源途径［4］。吴梦婷等[5]通过质体转基因技术，将抗人源 IL-6 scFv 基因在质体转基因烟草中成功转录和翻译，功能性抗人源 IL-6 scFv 在质体转基因烟草叶片中的含量占到总可溶性蛋白的1%，达到41 mg/kg 鲜重。通过烟草还可成功制备狂犬病抗体、抗蛇毒血清抗体、预防龋齿的单克隆抗体、治疗非霍奇金淋巴瘤的IgG抗体等[6]。

1.1.2  种子、胚乳生物反应器  水稻种子、胚乳细胞都可作为理想的“蛋白质生产车间”，成功生产人血清白蛋白、人抗胰蛋白酶、人生长激素等。水稻种子胚乳组织是常用的胚乳生物反应器，不仅利于提取纯化，同时成分简单、无复杂次级代谢产物干扰。2000 年Stöger 等[7]利用谷类（水稻、小麦）成功表达了针对癌胚抗原的单链 Fv抗体，实现了从烟草等模式植物系统到谷物类农作物的转变。日本科学家将外源蛋白蛋白CRY J1和CRY J2富集于水稻籽粒中，发现喂食上述大米的小鼠和猴子感染雪松花粉之后，花粉敏感症状减轻[8]。虽然利用谷类和豆类的种子生产外源蛋白能够长期保持稳定性，简化下游提取纯化过程，但种子类宿主在开花授粉等过程中可能造成基因污染。

1.1.3其他生物反应器  其他生物反应器包括悬浮细胞生物反应器、果实或根茎类生物反应器等。细胞悬浮系是指在富含营养液中建立稳定的悬浮细胞系，利用植物细胞大规模表达重组药用蛋白，烟草、苜蓿、 番茄、大豆、水稻和红花等植物均有实践。植物细胞悬浮液反应器具有遗传代谢稳定、快速繁殖、培养简单、易操作、污染风险低等优点。

1.2表达系统及机制

1.2.1瞬时表达系统  将外源基因序列进入宿主细胞后，独立于宿主基因组进行转录和翻译，并在宿主细胞内积累表达外源蛋白的方式为植物反应器瞬时表达系统，瞬时表达因具有表达量高、周期短、成本低、简单快速的特点成为应用植物生物反应器首选方式[9]，被广泛用于外源蛋白的生产。常用的表达方法包括农杆菌渗透法和病毒载体表达等。Carlsson [10]等通过电穿孔法将含有T-DNA基因载体转入根癌农杆菌后对烟草叶片注射细胞培养液实现侵染，成功表达了高活性肌红蛋白。病毒载体表达主要是以植物病毒为载体，将目的基因克隆到载体启动子下游区域，随后在体外进行转录，再通过直接侵染、基因枪或农杆菌侵染方式进入植物细胞。病毒载体表达较农杆菌渗透法，基因载体体积小，活跃产品表达，促进产品分离及提纯。

1.2.2  稳定表达系统  稳定表达系统是通过细胞核转基因技术和质体 (叶绿体) 转基因技术，将外源目的基因导入植物细胞中，使其在植物基因组中稳定地整合，并诱导长成新的植株，最终成为表达目标蛋白的植物品系，实现目标蛋白的持久表达。细胞核转基因技术是将基因随机插入并整合到植物染色体的核基因组中，产生可在组织培养条件下或者农场中生产的种子或营养组织，从而生产外源蛋白，但由于可能存在随机插入导致基因失活，及潜在的基因污染风险，阻碍了外源蛋白商业化发展。质体转化是将外源基因经同源重组的方式定点整合到叶绿体基因组中，组装产生大分子外源蛋白，维持蛋白的功能，实现外源蛋白高水表达。介于大部分植物质体基因通过花粉产生基因漂移的概率极低，而且经过冷冻、干燥或者高温处理后的质体转基因植物叶片，质体内的药用蛋白依旧非常稳定[11]，提取质体即可获取药用蛋白，因此质体工程具有高稳定性、分离成本降低的优势，已成功生产用于治疗老年痴呆症、糖尿病、高血压、血友病、视网膜病以及艾滋等多种疾病的药物蛋白，为转基因植物规模化生产药用蛋白商业化运用提供可能。

2 提高药用蛋白表达效率的策略  通过调控外源蛋白转录和翻译修饰过程，可大幅提高外源蛋白产量和质量。运用基因靶向和基因编辑技术，对目的基因同义密码子进行调整，达到提高翻译效率、增强蛋白表达量的目的[12]。植物和人类的 N-聚糖结构在组成方面存在差异会影响重组蛋白的物理化学和生物特性，糖工程学通过转移哺乳动物的糖基化途径相关酶到植物中，以模拟人类糖基化路径，可生产人体兼容结构的蛋白质糖型，这有助于生产具有类似于人类糖基化的蛋白质，从而提高其生物活性和减少免疫原性；也可通过糖删除技术可避免植物特异性N-聚糖修饰。利用多元 CRISPR/Cas9技术使水稻中α-1,3-岩藻糖转移酶等失去活性，成功表达人源药用蛋白。另外，选用合适的靶向蛋白酶抑制剂以及蛋白质稳定伴侣可应对外源蛋白的降解，提高药用重组蛋白数量和质量[13]。

3 药用蛋白应用及评价 近年来，多种植物源性抗体、各种酶制剂、激素、血蛋白、生理营养因子等医用产品进入临床试验阶段，有的已获批上市，实现商业化生产[14]。经转基因胡萝卜细胞的葡糖脑苷脂酶用于治疗β-葡萄糖脑苷脂酶减少或缺乏引起的遗传代谢病高雪氏病，是最早由美国FDA批准上市的植物源药用蛋白，临床效果较好且价格较药物便宜。杨柳等[15]在既往植物源重组人血清白蛋白临床前研究基础上，利用酶联免疫吸附试验探讨植物源重组人血清白蛋白能否与过敏血清中的过敏原特异性IgE抗体结合，证实了植物源重组人血清白蛋白潜在致敏性较低，药物安全性评价较好。癌症治疗抗体，如治疗HER2 阳性乳腺癌的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗以及治疗多种肿瘤的贝伐单抗均已在植物中成功表达，但还需要在哺乳动物细胞水平以及个体水平进一步检测生物活性和安全性，以及加快产业化进程。

4 展望  近几十年来，全球对生物制药需求的增加及植物生物反应器的深入研究，促进了基因工程药物产业的发迅速展。虽然利用植物生物反应器生产疫苗、药用蛋白等具有十分广阔的前景，但仍面临许多待优化的技术问题，如何通过优化转基因构建、优化转录调控元件、选择基因组整合位点、控制环境和生长条件来提高蛋白表达水平的稳定性，以及进一步开发实现植物生物反应器生产外源蛋白的糖基化的完全“人源化”基因工程，同时探讨更多合适的靶向蛋白酶抑制剂，减少外源蛋白降解，促进蛋白质稳定是未来生产植物源性药用蛋白亟需解决关键环节，另外，转基因药品安全及临床应用效果需进一步探讨。随着基因工程和人工智能发展，植物生物反应器的发展将进入一个新的阶段，通过对植物基因组精确和针对性的基因组编辑，未来将会发现更多具有药用价值的蛋白质，外源蛋白表达的质量和产量也会进一步提高。

参考文献

[1]Buyel J F. Plant molecular farming-integration and exploitation of side streams to achieve sustainable biomanufacturing[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 9:1893.

[2] Ghag S B， Ad ki  V S , Ganapathi T R, et al. Plant platforms for efficient heterologous protein production[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE,2021,26(4):546-567.

[3]Fausther-Bovendo H, Kobinger G. Plant-made vaccines and therapeutics[J]. Science, 2021,373(6556): 740-741.

[4] Miettinen K, Dong L M, Navrot  N, et al. The seco-iridoid pathway  from Catharanthus  roseus[J]. Nat Commun, 2014, 5: 3606.

[5]吴梦婷，王海涛等.利用植物质体转基因技术高效表达抗人源白介素 6 单链抗体[J].医药生物技术，2022,38(6):2269-2280.

[6]Phoolcharoen W, Prehaud C, van Dolleweerd C J, et al. Enhanced transport of plant-produced rabies single chain antibody-RVG peptide fusion protein across an in cellulo blood-brain barrier device[J]. Plant Biotechnology Journal, 2017, 15 (10):1331-1339.

[7]Stöger E, Vaquero C, Torres E, et al. Cereal crops as viable production and storage systems for harmaceutical scFv antibodies[J]. Plant Molecular Biology, 2000,42(4):583-590.

[8]Takaiwa F, Yang LJ, Takagi H, et al. Development of rice-seed based oral allergy vaccines containing hypoallergenic Japanese cedar pollen allergen derivatives for immunotherapy[J]. J Agric Food Chem, 2019,  67(47): 13127-13138.

[9]Buyel JF. Plant molecular farming - integration and exploitation of side streams to achieve sustainable biomanufacturing[J].. Front Plant Sci, 2019, 9: 1893.

[10]Carlesson M L R, Kanagarajan S, Bülow L, et al. Plant based production of myoglobin-a novel source of the muscle heme-protein[J]. Scientific Reports, 2020, 10:920.

[11]Hoelscher M, Tiller N, Teh AY, et al. High-level expression of the HIV entry inhibitor griffithsin from the plastid genome and retention of biological activity in dried tobacco leaves[J]. Plant Mol Biol, 2018, 97(4): 357-370.

[12]Smith J, Zhang, Y. Purification Techniques for Natural Medicinal Proteins from Plant and Animal Sources[J]. Journal of Biomedical Research, 2020, 34(2), 145-159.

[13]Mirzaee M, Osmani Z, et al. Recent advances in molecular farming using monocot plants[J]. Biotechnology Advances, 2022, 58:107913.

[14]邹奇，潘玮松，邱健等. 植物生物反应器优化策略与最新应用[J].中国生物工程杂志，2023,43(1):71-86. 

[15]杨柳，秦文，王丽媛等. 利用血清筛选和模拟胃肠液消化稳定性试验评价植物源重组人血清白蛋白潜在致敏性[J].中国食品卫生杂志，2022,34(1):34-38.