新冠病毒核酸实验室检测通量的预测与实践探讨

摘要 目的 通过对核酸检测试剂、设备、耗材、人员的精准把控，预测核酸检测通量，并在实际检测工作中加以验证，确保新冠核酸检测工作的顺利进行。方法 通过对核酸检测方法、试剂和设备的实现，评估检测周期；通过利用检测周期中的扩增分析，实现提取时间的合理对接；通过对提取时间的评估，合理安排检测前试剂、耗材以及样本的准备。通过上述评估，实现对人员、设备和场地的科学安排和设置，达到确保新冠核酸检测的顺利进行。结果 10台96通道扩增仪，1台16通道扩增仪，1台32通道自动提取仪、3台96通道自动提取仪，32人及合理的区域组合可完成7000-11000人份/天的检测通量，满足当地检测需求。结论 大批量的核酸检测，需要预先进行精确的测算，在确保检测质量的基础上进行科学增量,达到更优化的检测能力和检测质量。

新冠肺炎的诊断需结合流行病学史、临床表现、肺炎影像学特征以及病原学检测结果，其中病毒核酸检测阳性或病毒基因测序和新型冠状病毒高度同源是确诊新冠肺炎的金标准[1]。虽然有更多的快速检测方法，但是病毒核酸检测简便、快速，且成本相对较低，是目前新冠肺炎确诊的最主要方法。实时荧光 RT-PCR 是新型冠状病毒肺炎确诊最主要的方法，在早期发现、隔离以及治疗新型冠状病毒肺炎患者中均起着重要作用[2-3]。新冠肺炎流行期间，随着感染者的逐渐增多，防控政策逐渐转向全民预防，这样对于县级医疗机构带来巨大挑战，尤其是新冠核酸检测能力，涉及到设备购置、试剂耗材采购、实验室设计、人员安排、检测量评估和检测质量保证等方面的工作。其中在检测质量保证的基础上，确保检测量能够满足要求，是人群广泛检测的重中之重。本研究重点对本地区新冠核酸检测实验室检测通量和实践情况进行探讨，为突发公共卫生事件检测能力的构建提供理论和实践基础。现报道如下：

1. 实验试剂、设备、方法及耗材

1.1实验试剂

1.1.1达安基因“新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)” ，试剂盒的预期用途：用于体外定性检测新型冠状病毒肺炎疑似病例、聚集性病例、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子、鼻咽拭子和痰液样本中，新型冠状病毒(2019-nCoV)0RFlab和N基因。

1.1.2提取试剂

中元汇吉生物技术股份有限公司 用于样本中核酸(DNA/RNA)的提取、富集、纯化等步骤。

1.2实验设备

扩增仪：雅睿MA-6000；杭州安誉AGS8830-16

提取仪：中元汇吉（ZYB10）EXM6000

1.3实验方法

1.3.1 RT-PCR技术：选取新型冠状病毒2019-nCoV0RFlab和N基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针用于标本中新型冠状病毒RNA的检测。其作用机理是选择性水解双链或者单链 DNA 中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的 DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。

1.3.2 磁珠法提取 核酸提取试剂盒（磁珠法）产品采用的磁性颗粒表面具有特异吸附核酸(DNA/RNA)的多聚基团。在高盐等特殊条件下，待测样本中的细胞或病毒快速裂解，释放出核酸，被磁性颗粒特异性吸附，利用磁性分离器将吸附有核酸的磁性颗粒与液相分离，通过洗涤去除溶解在液相中的残留杂质和抑制物，最后通过改变液相条件，使核酸从磁珠上洗脱下来，达到快速高效分离核酸的目的。

1.4 试验耗材

试验用病毒采样管、枪头、试管和盐水等随医院检验科采购。

2. 实验周期的评估

2.1扩增周期的评

根据试剂扩增说明书，理论扩增周期14.5min，实际扩增周期：杭州安誉AGS8830-16需40min，雅睿MA-6000需55min

经过评估，每台设备扩增周期不同，如果加入准备和人工扩增板放置和程序启动等时间，约需1h。杭州安誉AGS8830-16每次扩增可扩增16孔，每次检测标本最多10pool，雅睿MA-6000每次可扩增96孔，每次检测标本最多90pool。。

2.2提取周期的评估

根据试剂提取说明书，提取时间9min，最大提取量为96孔：标本90，空白2，阴性对照2，阳性质控2。

经过评估，每台中元汇吉（ZYB10）提取仪提取时间需要9分钟，提取量为90份待提取样本。若加上上机准备时间约需15min。

2.3试剂、耗材和样本的准备

试剂提前分装和准备，首次带平衡至室温时间大约需要30min，可随时进行准备。耗材由试剂管理人员按照使用量进行分配。样本由采集人员送回后，集中保存。待准备提取时安排人员进行提取。上述用时均按采集和使用量而定。

2.4实验运行方案

2.4.1最大检测时间

通过上述评估结果，可以发现，如果满负荷进行运转，16通道扩增仪尽时间为40min，增加准备时间20min，约需60min。96通道尽时间为55min，增加准备时间20min，约需75min。这样除去每班清洁消毒2h，20h有效时间内同时运行，每天96通道扩增仪，可扩增16次，16通道扩增仪可扩增20次。最大满负荷运转需要仪器设备全部正常，且试剂耗材，实验环境和人员配备全部能得到保障。

提取仪每次提取需要15min，如果预估准备时间，预计需要20min/次。这样无论单检还是混样，提取一批可供扩增仪满负荷扩增1次。因此次扩增会增加因提取延迟的时间至少20min。每台提取仪每提取1次，间隔20min才能再次启动1台扩增仪。

2.4.2最大检测通量

通过上述评估结果可以发现，提高工作效率的关键在于合理利用扩增时间，提高日工作量的关键在于科学配置扩增设备和人员。我院使用8台96通道的扩增仪，1台16通道的扩增仪。每次可同时扩增标本720pool和10pool。若按照20混样标本进行检测，可同时扩增730pool，可检测（720+10）×20=14600人份。若留16通道作为急诊或者阳性拆分用，最多扩增720pool，合计14400人份。按照96通道每天16次的最大扩增量，可计算出，最多混检量为233600人份。16通道可扩增20次，能够拆分320样本。

我院配备有1台32通道提取仪，3台96通道提取仪。按上述评估，理论上，每隔20min可运行3台扩增仪，这样可以循环运行。96通道每天可进行至少8次扩增，按20混样，可检测116800人份，若按照平均混样量为6混，可检测35040人份/天。

上述为理论每天可满负荷运行的检测通量。由于混样数量选择（可能是单检、2混、8混、16混等情况），样本送检时间，结果判断和分析，实验中每台设备交叉运行所需耗时等多种情况影响，能够达到理论工作效率的60%，即检测量能够达到21024人份/天。

2.5实验运行结果

由表3可见，随着时间的推移，我院设备和人员配备的增加，实际检测量完全在理论预期之内。检测效率达到了原理论评估效率的52.3%，满足我院最大检测要求。

3. 讨论

实验室提取设备与扩增设备的数量与速度，决定了实验室的检测能力。提取设备与扩增设备的合理搭配方能达到检测能力的最大化。选择合适通量与速度的提取设备,决定了样本的处理能力[4]。为在大规模病毒核酸筛查中发挥实验室最大检测能力，检测实验室应有完整的制度，从组织管理、人员评估、仪器设备配置、各区岗位设置及工作流程方面做出细化安排。流程全过程以信息化为支撑，同时兼顾检验前样本采集、运送效率，目的是做到样本不间断供应下，实验室核酸检测全速进行。还应注意的是，大规模新冠病毒核酸筛查还要保证检测质量，因此应充分注意检验人员技术培训、最大程度避免假阴性或假阳性、检测系统的最低检出限、以及混采阳性的单管追踪闭口等问题。

本研究通过对所配置的扩增仪扩增时间和提取仪提取时间的充分预估，对关键环节进行控制[5]。对试剂耗材准备，样本准备时间的充分评估，科学的结合提取和扩增时间，从而配置合理的设备实现日提取[6]和扩增所需最大通量的评估。通过实践证明样本检测量在预估范围内，实验室可以在相对稳定情况下承担本地区检测量。当然，检测量是检测能力的一个重要环节，还需要通过性能验证、质量控制和室间质评等来确保检测质[7-8]，这样才能真正对检测能力有量和质的提高。

综上所述，通过从关键步骤入手，逐渐推演，结合工作流程和人员等进行科学评估能够更加有效的对实验室检测能力测评，从而能够把控实验室的检测量和伸缩空间，做好充足准备，更好的应对突发公共卫生事件。

参考文献

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[2]陈馨宁,黄斐,张春燕,潘柏申.分子诊断技术在新型冠状病毒核酸检测中的应用及发展[J].临床检验杂志,2021,39(6):401-406.

[3]李泽锐,高静,刘兴旺.RT-PCR技术在新型冠状病毒核酸检测的应用及质量评价分析[J].中国实用医药,2023,18(19):163-165.

[4]贾兴旺.临床实验室新冠核酸检测质量保证及检测能力提升方案[J].标记免疫分析与临床,2022,29(5):721-725.

[5]李俊英,葛文超,王艺芳,王顼,杨贺才,方建华.浅谈核酸检测关键环节的质量控制[J]中国卫生检验杂志,2020,30(11):1404-1406.

[6]李林森,朱超,赵新颖,屈锋.分离技术在新型冠状病毒研究和防疫检测中的应用[J]色谱,2021,39(7):679-685.

[7]张礼堃,邹秉杰.PCR技术在新冠病毒核酸检测中的应用[J].医学研究生学报,2021,34(5):539-544.

[8]李晓宾,李君萍,穆贝莉,程晓兰.新型冠状病毒检测系统性能验证分析[J].口岸卫生控制,2022,27(4):49-53.