临床分离两株萜烯诺卡菌的分子鉴定及基因组特征分析

【摘要】目的 对临床分离的诺卡菌进行分子鉴定，并分析其基因组特征。方法  从临床脑脊液和肺泡灌洗液中分离获得2株萜烯诺卡菌（NT001、NT002），基因测序进行菌种鉴定，并通过生物信息学进行功能注释。结果 系统发育分析显示两株菌亲缘关系较近但存在种内差异。生长曲线显示二者生长速率存在明显差异。基因组分析表明NT001含染色体及质粒结构。基因功能注释显示，该菌株基因组中包含多种与基础代谢及细胞结构相关的编码基因，可能参与免疫逃逸及细胞损伤过程。结论 本研究完成了两株临床分离诺卡菌的分子鉴定及基因组特征分析，为诺卡菌的分类鉴定及后续功能研究提供基础数据支持。

关键词：诺卡菌；16S rRNA；萜烯诺卡菌；基因测序；生长特性；

Molecular Identification and Genomic Features of Two Clinical Isolates of Nocardia terpenica

Wan Qiong1, Xiong Yameng2, Zeng Lingbing3

1Hospital Infection Management Division, the First Hospital of Nanchang, Jiangxi, 330000, China

2Hospital Infection Management Division, Nanchang Hongdu Traditional Chinese Medicine Hospital, Jiangxi, 330000, China

3Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi, 330000, China

Corresponding author：Xiong Yameng, Email:282897648@qq.com

【Abstract】Objective  To perform molecular identification of clinically isolated Nocardia strains and analyze their genomic characteristics. MethodsTwo strains of Nocardia terpenica(NT001 and NT002) were isolated from clinical cerebrospinal fluid and bronchoalveolar lavage fluid. Species identification was conducted via gene sequencing, and bioinformatics analysis was applied for gene functional annotation. ResultsPhylogenetic analysis revealed a close genetic relationship but intraspecific differences between the two strains. Growth curves indicated significant disparities in their growth rates. Genomic analysis demonstrated that strain NT001 possessed a chromosome and a plasmid. Gene functional annotation showed that the genomes of the strains harbored numerous genes encoding proteins associated with basic metabolism and cellular structures, which may be involved in immune evasion and cellular damage. ConclusionThis study completed the molecular identification and genomic characterization of the two clinically isolated Nocardiastrains, providing fundamental data for the classification, identification and subsequent functional research of Nocardia.

【Key words】:Nocardia; 16S rRNA; Nocardia terpenica; genome sequencing;

growth characteristics.

诺卡菌病属于人畜共患感染性病症，病程可表现为急性发作，也可迁延发展为慢性病变，致病菌为诺卡菌属微生物，其分离溯源最早可追溯至1888年，学者Edmond Nocard从罹患淋巴腺炎的病牛体内首次分离出该致病菌；时隔一年，Trevisan完成该菌株生物学特征的系统描述，并将其正式命名为鼻疽诺卡菌。在此之后，全球各地陆续报道多起诺卡菌感染病例[1]。机体免疫功能存在缺陷的人群是诺卡菌感染的高发群体，艾滋病感染者、恶性肿瘤患者、器官移植术后人群，或是长期大剂量使用糖皮质激素进行治疗的患者，感染风险会显著升高。病菌侵入人体主要存在三条途径：经呼吸道吸入带菌气溶胶、污染介质接触皮肤破损处造成直接定植、经血行途径发生全身播散。病菌侵入后可侵袭肺组织、皮肤、脑组织、肾脏等多处脏器，在受累部位诱发急性、亚急性或慢性炎症损伤[6]。诺卡菌主要传播途径包含呼吸道吸入、破损皮肤创面接触、血行播散，该病原菌可侵袭肺、皮肤、脑、肾脏等多个脏器，引发急性、亚急性以及慢性炎症。大量临床研究表明，诺卡菌所致脑脓肿预后与患者机体免疫状态密切相关，免疫缺陷患者死亡率可达55%，免疫功能正常患者死亡率为20%，该致死率远高于其他细菌性脑脓肿；现有研究证实该病原菌无法在人与人之间传播[9]。细菌对宿主的黏附与侵袭，是病原菌启动感染过程的关键环节。现有研究证实，诺卡菌致病性与其细胞壁组分、毒素合成能力以及宿主细胞互作过程密切相关。目前临床治疗诺卡菌病的首选药物为磺胺甲恶唑/甲氧苄啶（TMP-SMX），受感染部位与疾病分型差异影响，临床用药方案存在区别。现阶段该病暂无统一标准化治疗疗程，需结合患者临床症状及自身免疫功能综合判定。现阶段国内外诺卡菌相关研究多聚焦于流行病学调查与临床病例回顾分析，针对菌株毒力因子功能、具体分子致病机制的深层次研究仍较为欠缺。临床多采用PCR扩增细菌管家基因完成菌株测序鉴定，16S rRNA基因为细菌体内高度保守的特征序列，依托该基因开展菌种鉴别，是最早应用于细菌菌种鉴定的分子生物学手段，目前已成为业界公认的菌种快速鉴定金标准[10]。萜烯诺卡菌基因组相关研究进展较为迟缓，目前公共基因数据库仅收录一株萜烯诺卡菌全基因组草图，该菌种分子层面基础研究仍有待完善。本研究依托前期实验基础，从2例临床患者的脑脊液（CSF）与肺泡灌洗液标本中，分离获得萜烯诺卡菌NT001、NT002菌株，通过全基因组测序，对比分析两株菌株的毒力基因、可转移遗传元件与差异基因，同时开展多菌株比较基因组学分析，旨在明确萜烯诺卡菌的种群遗传多样性及生长表型差异，弥补该菌种致病机制研究的空白，为后续深入剖析诺卡菌致病机制提供实验依据。

1实验方法

测序DNA基因组的提取

(1)本实验采用试剂盒法提取萜烯诺卡菌NT001KRSH菌株基因组DNA，具体操作步骤如下：将供试诺卡菌接种于BH液体培养基，设置培养温度35℃，恒温培养48h。吸取1.5mL菌液置于离心管内，12000rpm高速离心1min，舍弃上层清液，保留底部菌体沉淀。

（2）菌体破壁处理：向沉淀中添加180μLTE缓冲液，再加入50μL浓度20mg/mL的溶菌酶溶液，混匀后37℃水浴保温不少于30min，完成细菌细胞壁裂解。需注意，溶菌酶溶液需现配现用，且必须以TE缓冲液溶解干粉制备，避免溶剂不符导致酶活性失效。随后加入20μL蛋白酶K溶液，充分混匀后56℃水浴消化3h，彻底降解菌体蛋白。

（3）后续核酸纯化操作：向体系内加入220μLGB缓冲液，剧烈振荡15s后，70℃水浴静置10min，待溶液完全澄清后瞬时离心，去除管盖与管壁附着水珠。加入等体积无水乙醇振荡混匀15s，再次瞬时离心除水珠。将全部反应液与析出的絮状沉淀转移至吸附柱CB3中，12000rpm离心1min，弃去收集管废液。

（4）依次完成洗涤与洗脱流程：先后加入GD缓冲液、PW漂洗液对吸附柱进行洗涤，单次洗涤离心参数均为12000rpm、1min，漂洗液洗涤步骤重复2次。洗涤结束后空管离心3min去除残留废液，室温敞口放置数分钟，彻底挥发残留乙醇。最后向吸附膜中央悬空滴加50~200μLTE洗脱缓冲液，室温静置3min，12000rpm离心2min，收集离心管内洗脱液，即为纯化后的菌株基因组DNA。

 16s rRNA基因测序

(1)选用细菌通用引物扩增菌株16S rRNA基因，上游引物F序列：5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物R序列：5‘-CGGTTACCTTGTACGACTT-3’，目标扩增片段长度约1500bp。PCR扩增程序设置：94℃预变性5min；随后进行30个循环扩增，循环参数为94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸80s；循环结束后72℃终延伸5min。

（2）扩增产物检测与测序分析：取5μL PCR扩增产物，采用1%琼脂糖凝胶电泳，120V电压电泳30min，凝胶成像系统观测电泳条带，若条带位置与1500bp Marker对齐，则判定扩增合格。将合格PCR产物送至上海生物工程股份有限公司完成一代测序。测序原始序列上传至NCBI数据库，通过BLAST工具开展同源序列比对，从分子水平鉴定受试菌株种类。

5.全基因组测序方法

本研究结合PacBio三代测序与Illumina二代测序平台，完成萜烯诺卡菌NT001KRSH全基因组测序。三代测序文库构建：取用5μg合格基因组DNA，通过g-TUBE设备进行片段打断，利用AMPure磁珠筛选纯化8~12kb目的片段，依托DNA Template Prep Kit 2.0试剂盒构建10kb插入片段文库，最终在PacBio RSII测序平台上机测序。

二代测序文库构建：取用1μg基因组DNA，经Covaris S2超声破碎仪打断DNA，切胶回收300bp目的片段，通过TruSeqTM DNA Sample Prep Kit-Set A试剂盒构建文库，搭配Truseq PE Cluster Kit完成簇扩增，于Illumina测序平台完成双端测序。

测序数据处理与校正结果：三代原始测序数据共获得80490条读长，数据总量1312M，序列平均长度16297bp；去除接头序列后得到有效清洁数据193244条，数据量1305M，平均读长6752bp。二代双端测序共获得10697116对有效序列。采用HGAP软件完成三代测序数据基因组从头组装，获得contig序列、序列长度及基因组GC含量信息；借助samtools软件比对二代测序数据，完成基因组单核苷酸位点变异（SNP）与插入缺失位点（Indel）校正，最终校正结果显示，该菌株基因组无SNP突变位点，共检测出33个Indel变异位点。

2结果

(1）.诺卡菌属16S rRNA系统进化树的构建

扩增萜烯诺卡菌NT001、NT002菌株16S rRNA基因片段，明确两株菌分类地位。选取结核分枝杆菌H37Rv、衣氏放线菌CIP103259作为外类群，搭配NCBI数据库中人、动植物、土壤来源的10株已完成全基因组测序的诺卡菌，构建16S rRNA系统进化树（图3.2）。进化树结果表明，本实验两株菌株遗传亲缘关系最近，但和萜烯诺卡菌AUSMDU00012715分属不同进化支，证明同种菌株内部存在遗传分化；系统发育比对同时证实，NT001、NT002与新星诺卡菌SH22a进化距离更近。

图1基于16srRNA的诺卡菌系统进化树

（2）.萜烯诺卡菌NT001株和NT002株的生长特性比较

研培养观察发现NT001与NT002生长特征差异显著，采用干重法测定并绘制二者生长曲线（图2），试验设置三组生物学重复。以培养时长为横轴、菌体干重为纵轴绘图后可见，两菌株增殖速率差距明显：NT001接种12h后快速增殖，76h生物量达到峰值；NT002迟至接种24 h才进入对数生长期，菌体干重持续累积，120h才抵达生长最高点。

图2萜烯诺卡菌NT001株和NT002株生长曲线

（3）.萜烯诺卡菌NT001株NT002的基因组信息

结联合Illumina与PacBio平台完成NT001完整基因组测序组装，该菌株包含一条8.85Mbp染色体与一段70Kbp质粒（图3.4），染色体、质粒GC含量分别为68.5%、68.3%。功能注释显示其携带56个tRNA、9个rRNA，预测7926条编码序列，其中蛋白编码基因7718个。以NT001基因组为参照完成NT002测序分析，该菌株组装得到119条重叠序列，染色体总长8.87Mbp，GC含量68.5%；基因组注释得到53个tRNA、3个rRNA，共8659条编码序列，编码蛋白7729个。 

图3萜烯诺卡菌NT001株的基因组圈图和质粒圈图

A 萜烯诺卡菌NT001株的基因组圈图，B 萜烯诺卡菌NT001株的质粒圈图。由外圈至内圈分别代表：染色体序列（深蓝色）、CDS forward strand（绿色）、CDS reverse strand（紫色）、非CDS功能（天蓝色）、AMR基因（红色）、VF基因（黄色）、转运蛋白（蓝色）、药物靶标、GC内容、GC倾斜。

图4萜烯诺卡菌NT002株的基因组圈图

由外圈至内圈分别代表：染色体序列（深蓝色）、CDS forward strand（绿色）、CDS reverse strand（紫色）、非CDS功能（天蓝色）、AMR基因（红色）、VF基因（黄色）、转运蛋白（蓝色）、药物靶标、GC内容、GC倾斜。

3讨论：诺卡菌属为⼀类重要的条件致病菌，其分类复杂且临床鉴定难度较⼤。传统表型鉴定⽅法存在周期⻓、准确性有限等问题，⽽分⼦⽣物学⽅法，尤其是16SrRNA基因测序，已成为诺卡菌鉴定的重要⼿段。本研究通过16S rRNA测序对两株临床分离菌进⾏鉴定，结果显⽰两株菌亲缘关系较近，但未完全与参考菌株聚类，提⽰萜烯诺卡菌在种内可能存在⼀定遗传多样性，这与既往研究结果⼀致。⽣⻓特性分析结果显⽰，NT001株与NT002株在⽣⻓速率及⽣⻓周期上存在明显差异。该差异可能与菌株来源、遗传背景及环境适应能⼒有关。不同⽣⻓特性可能进⼀步影响其在宿主体内的定植能⼒及致病潜能，但具体机制仍有待进⼀步研究。基因组分析结果表明，NT001株具有典型放线菌⾼G+C含量特征，其基因组规模较⼤，编码基因丰富。质粒的存在提⽰该菌株可能具有⼀定的基因可塑性，在环境适应及功能演化中发挥潜在作⽤。

功能注释结果显⽰，该菌株基因主要参与基础⽣命活动过程，为其⽣存及增殖提供分⼦基础，综上，本研究从分⼦⽔平对临床分离诺卡菌进⾏了系统分析，初步揭⽰了其分类地位、⽣⻓特性及基因组特征。但本研究仍存在⼀定局限，如仅对单株菌进⾏完整基因组分析，且缺乏功能验证实验。

参考文献

[1] [1] Fatahi-Bafghi M. Nocardiosis from 1888 to 2017[J]. Microbial Pathogenesis, 2018, 114: 369-384.

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[3] [9] Fleetwood I G, Embil J M, Ross I B. Nocardia asteroides cerebral abscess in immunocompetent hosts: report of three cases and review of surgical recommendations[J]. Surg Neurol, 2000, 53(6): 605-610.  

[4][10]Brown-Elliott B A,Brown J M,Conville P S,et al.Clinical and laboratory features of the Nocardia spp.based on current molecular taxonomy[J].Clin Microbiol Rev,2006,19(2):259-282.