基于生物信息学的结直肠腺瘤差异基因筛选与实验验证

摘要：目的：本研究筛选结直肠腺瘤差异表达基因，验证候选基因在腺瘤组织中的表达特征。方法：本研究整合GEO数据库GSE20916、GSE8671、GSE15960、GSE37364基因芯片数据，纳入122份结直肠腺瘤样本和120份正常黏膜样本。本研究采用limma分析差异表达基因，采用GO和KEGG开展功能注释，采用STRING和Cytoscape筛选关键节点。本研究对10对结直肠腺瘤石蜡组织及对应正常组织开展CA2、SLC4A4免疫组化和原位杂交检测。结果：本研究共筛得3527个差异表达基因，其中上调1179个，下调2348个，4个数据集共有44个差异基因。本研究筛得ASCL2、LGR5、CHGA、REG4、CA7、CA2、SLC4A4、CA1共8个关键基因。免疫组化检测中，CA2与SLC4A4各连续变量比较的P值均＞0.05，IRS≥2阳性例数构成的P值为1.000。原位杂交检测中，SLC4A4与CA2的阳性细胞比例、H-score、IRS比较的P值分别为0.020、0.024、0.045。结论：CA2和SLC4A4在结直肠腺瘤组织中具有异常表达特征。本研究结果为结直肠腺瘤分子分层和高危病变识别提供了候选指标。

关键词：结直肠腺瘤；生物信息学；差异表达基因；CA2；SLC4A4

结直肠癌的发生存在由正常黏膜、腺瘤到腺癌的多阶段演变过程，结直肠腺瘤是具有干预价值的癌前病变。临床肠镜检查能够发现腺瘤病灶，病灶的恶变潜能仍需要病理特征和分子信息共同评估[1]。公共转录组数据能够提供大样本基因表达信息，组织学实验能够验证候选基因的组织表达[2]。本研究整合4个GEO数据集筛选结直肠腺瘤差异表达基因，并以免疫组化和原位杂交检测验证CA2、SLC4A4的表达特征。

1 资料及方法

1.1 一般资料

本研究的生物信息学资料来源于GEO数据库，数据集包括GSE20916、GSE8671、GSE15960、GSE37364，芯片平台均为GPL570。4个数据集共纳入122份结直肠腺瘤组织和120份正常黏膜组织。实验验证资料来源于10对结直肠腺瘤石蜡组织和对应正常组织切片。组织样本均完成病理学确认。样本使用经伦理审查批准，研究对象均完成知情同意程序。

1.2 方法

本研究下载原始表达矩阵和平台注释文件。本研究对探针进行基因符号注释，对多探针对应同一基因的表达值取平均值。本研究采用R语言limma包完成标准化和差异表达分析。本研究以|log2FC|＞2、调整后P＜0.05作为筛选阈值。本研究采用DAVID开展GO和KEGG富集分析。本研究将共同差异基因导入STRING数据库构建蛋白互作网络，本研究以combined score＞0.4作为网络纳入阈值。本研究采用Cytoscape依据节点连接度筛选关键基因。本研究使用CA2、SLC4A4抗体开展免疫组化染色和原位杂交，本研究以阳性细胞比例、阳性细胞密度、H-score和IRS评估表达。

1.3 观察指标

本研究设置3项观察指标。第一项观察指标为差异表达基因筛选结果，本研究记录各数据集的上调基因数、下调基因数、共同差异基因数和关键基因筛选结果。第二项观察指标为CA2和SLC4A4免疫组化表达结果，本研究记录两种蛋白的阳性细胞比例、阳性细胞密度、H-score、IRS和IRS≥2的阳性例数。第三项观察指标为CA2和SLC4A4原位杂交表达结果，本研究记录两种基因信号的阳性细胞比例、阳性细胞密度、H-score、IRS和IRS≥2的阳性例数。

1.4 统计学方法

本研究采用SPSS 26.0软件完成统计分析。计量资料采用x̄±s表示，配对样本比较采用t检验。计数资料采用例数和百分比表示，率的比较采用χ²检验。双侧P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达基因筛选结果

本研究在4个GEO数据集中共筛得3527个差异表达基因，筛选结果见表1。各数据集内上调基因和下调基因构成的P值均＜0.001。韦恩图分析结果显示，4个数据集共有44个差异表达基因，其中18个基因上调，26个基因下调。蛋白互作网络分析筛得ASCL2、LGR5、CHGA、REG4、CA7、CA2、SLC4A4、CA1共8个关键基因。

表1 4个GEO数据集的差异表达基因筛选结果

注：χ²检验比较每个数据集中上调基因和下调基因的构成。

2.2 CA2和SLC4A4免疫组化表达结果

本研究的免疫组化切片显示，CA2和SLC4A4在腺瘤上皮细胞中均可见棕黄色至棕褐色阳性信号，检测结果见表2。两种蛋白的阳性细胞比例、阳性细胞密度、H-score和IRS比较的P值分别为0.656、0.884、0.721、0.850。两种蛋白IRS≥2阳性例数构成的P值为1.000。正常组织切片以弱阳性或阴性信号为主。

表2 结直肠腺瘤组织中CA2和SLC4A4的免疫组化表达（n=10，x̄±s）

注：t检验比较同一腺瘤样本中两种蛋白的连续变量；χ²检验比较IRS≥2阳性例数构成。

2.3 CA2和SLC4A4原位杂交表达结果

本研究的原位杂交切片显示，CA2和SLC4A4在腺瘤组织中均存在特异性杂交信号，检测结果见表3。SLC4A4的阳性细胞比例、H-score和IRS高于CA2，P值分别为0.020、0.024、0.045。两种基因阳性细胞密度比较的P值为0.070。两种基因IRS≥2阳性例数构成的P值为0.074。

表3 结直肠腺瘤组织中CA2和SLC4A4的原位杂交表达（n=10，x̄±s）

注：t检验比较同一腺瘤样本中两种基因的连续变量；χ²检验比较IRS≥2阳性例数构成。

图1 结直肠腺瘤及正常黏膜组织中CA2、SLC4A4蛋白（免疫组化）和mRNA（原位杂交）表达的代表性图片

讨论

结直肠腺瘤的分子改变发生于形态学恶变之前，稳定差异基因的识别具有早期风险评估价值[3]。本研究整合4个独立GEO数据集，样本总量达到242份，研究设计降低了单一数据集偏倚。3527个差异表达基因提示结直肠腺瘤形成过程中存在广泛转录调控失衡。44个共同差异基因保留了跨数据集一致性，8个关键基因位于蛋白互作网络中心。蛋白互作网络将分散的差异基因转化为相互关联的功能节点，CA2和SLC4A4由此成为具有进一步研究价值的候选分子[4]。该筛选策略使候选基因的确定具有数据一致性基础，也使组织实验验证具有明确靶点方向。

CA2编码碳酸酐酶Ⅱ，CA2参与细胞酸碱稳态维持。SLC4A4编码钠碳酸氢盐共转运体，SLC4A4参与碳酸氢盐跨膜转运和细胞内pH调节[5]。腺瘤细胞的增殖需要适应能量代谢、离子转运和局部微环境变化，酸碱调控相关分子的异常表达可能参与这一生物学过程[6]。免疫组化结果证明CA2和SLC4A4均可在腺瘤组织中检出，原位杂交结果提示SLC4A4具有更活跃的转录信号。蛋白表达和mRNA表达反映不同层面的分子状态，转录调控、翻译效率、蛋白降解和组织异质性均可影响两种检测结果的对应关系。CA2和SLC4A4的表达特征为腺瘤组织内代谢适应和离子稳态改变提供了组织学依据[7]。临床病理工作可将此类分子指标作为高危腺瘤评估的补充信息，分子检测结果仍需与病理分级、病灶形态和随访资料共同解释。

本研究的价值在于将公共数据库筛选结果与组织实验结果建立对应关系，使候选基因的发现具有多层次证据支持。本研究的实验验证仅纳入10对石蜡样本，本研究未对不同病理分级腺瘤开展分层比较。本研究未建立候选基因表达与腺瘤复发、进展或结直肠癌发生之间的预测模型。后续研究需要扩大多中心样本量，纳入低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变和腺癌连续病理谱样本。后续研究需要采用定量PCR、蛋白印迹和细胞功能实验评价CA2、SLC4A4对细胞增殖、迁移和微环境适应的影响。后续研究需要结合长期随访结局评价候选基因的风险分层效能。

参考文献

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项目编号：BNWJ202300133
项目名称：生物信息学技术筛选结直肠腺瘤差异基因表达