miR-199b-5p调控核心1β-1，3-半乳糖基转移酶对胃癌细胞恶性行为的影响

【摘要】目的：探究miR-199b-5p调控核心1β-1，3-半乳糖基转移酶对胃癌细胞恶性行为的影响。方法：利用生物信息学分析1β-1，3-半乳糖基转移酶在胃癌中的表达情况。根据miR转染情况进行分组，miR-199b-5p mimic组、空白对照、miR-199b-5p inhibitor组,检测3-半乳糖基转移酶的表达情况以及细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结果：胃癌细胞中C1GALT1表达高于正常胃粘膜(P<0.05)；瞬转miR-199b-5p mimic 后,C1GALT1蛋白水平下降( P<0.05)；瞬转miR-199b-5p inhibitor 后,C1GALT1表达升高(P<0.05)；miR-199b-5p mimic 24、48、72h后细胞增殖显著高于空白对照组(P<0.05)；miR-199b-5pinhibitor 24、48、72h后细胞增殖显著低于空白对照(P<0.05)。结论：miR-199b-5p通过调控B4GALT3的表达，影响了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，为胃癌的治疗提供了新的潜在靶点。

【关键词】microRNA-199b-5p；核心1β-1，3-半乳糖基转移酶；胃癌；细胞增殖；细胞迁移；细胞侵袭

胃癌起源于胃黏膜上皮，是消化道常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内均居高不下，对人类健康构成了严重威胁[1]。胃癌的发生往往伴随着一系列复杂的生物过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭等恶性行为，不仅加速了肿瘤的生长和扩散，也极大地增加了治疗的难度和患者的死亡率[2]。深入探究胃癌细胞恶性行为的调控机制，对于胃癌的早期诊断、治疗及预防具有重要的理论和实际意义[3]。近年来，随着分子生物学和生物信息学技术的飞速发展，越来越多的研究开始关注于胃癌细胞恶性行为调控的关键基因和分子。其中，核心1β-1，3-半乳糖基转移酶（C1GALT1）作为一种关键的糖基转移酶，其在胃癌的发生和发展中起到了重要作用[4]。C1GALT1是O-糖基化过程中的关键酶，主要参与IgA1等蛋白的O-糖基化修饰，进而影响其生物学功能。已有研究表明，C1GALT1的表达减少和（或）活性下降与胃癌的发生密切相关。miR-199b-5p作为其中一种具有广泛调控作用的miRNA，已被证实在多种癌症中发挥着重要的抑癌作用。本研究旨在探究miR-199b-5p调控C1GALT1对胃癌细胞恶性行为的影响具体如下。

1材料与方法

1.1细胞系及试剂

人胃癌BGC-823细胞系，miR-199b-5p过表达质粒，C1GALT1抗体，CCK-8试剂盒，Transwell小室，Matrigel基质胶等。

1.2细胞培养与转染

细胞培养：在含10% FBS的RPMI 1640培养基中培养胃癌细胞。基因转染：使用Lipofectamine 2000将miR-199b-5p过表达质粒转染至胃癌细胞。细胞功能实验：按照标准实验流程进行CCK-8、划痕、Transwell和Matrigel侵袭实验。蛋白表达检测：使用Western Blot检测C1GALT1蛋白表达水平.细胞凋亡检测：使用Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3细胞制备

从液氮罐中取出冻存的胃癌细胞，迅速置于37℃水浴中解冻，然后加入含10% FBS的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞生长至80%-90%融合度时，进行传代或实验。

1.3生物信息学分析

利用StarBase v2.09、TargetScan、以及GSCA等软件和数据库对C1GALT1的表达情况和miR-199b-5p的潜在靶基因进行分析，在胃癌样本中，C1GALT1基因的表达水平显著升高，C1GALT1基因的3'非翻译区（3'UTR）中存在miR-199b-5p的潜在结合位点。

1.4检测BGC-823细胞内C1GALT1蛋白的表达量

使用94:6的比例混合RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂PMSF，对细胞进行裂解，离心分离上清液，获取细胞裂解液中的总蛋白，应用BCA蛋白定量试剂盒，测定提取蛋白的实际浓度。根据每组实验需求，准备30μg的蛋白样品进行上样，配置10%的SDS-PAGE凝胶，用于蛋白的电泳分离，将蛋白样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离。将分离出的蛋白转移到PVDF膜上，使用封闭液在室温下对膜进行封闭，持续40分钟。封闭后，加入按1:1000比例稀释的C1GALT1和α-tubulin一抗，并在4℃摇床上孵育过夜（12至16小时）。次日将膜置于室温摇床上，孵育30分钟后进行清洗，清洗后加入按1:5000比例稀释的二抗，并在室温下孵育1小时。孵育结束后，使用TBST（Tris Buffered Saline with Tween 20）缓冲液对膜进行3次清洗。清洗完成，将膜与按1:1比例配置的ECL（Enhanced Chemiluminescence）化学发光显影液进行反应，保存实验结果。

1.5检测miR-199b-5p对BGC-823细胞增殖能力的影响

收集各组转染48h的BGC-823细胞系，并使用miR-199b-5p模拟物（mimic）行转染处理，应用CCK-8法、EdU掺入法或流式细胞仪等技术，定量检测转染后BGC-823细胞的增殖能力。记录并比较不同处理组之间的细胞增殖数据，使用统计软件对数据进行分析，以评估miR-199b-5p对BGC-823细胞增殖能力的具体影响。

1.6统计学处理

数据均录入软件Graph PadPrism分析，数据均符合正态分布，以均数±标准差（`x±s）描述，组间行独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1C1GALT1在胃癌组织中的表达情况对比 胃癌细胞中C1GALT1表达高于正常胃粘膜(P<0.05)，见表1。

表1C1GALT1在胃癌组织中的表达情况对比（`x±s）

注：与正常胃组织相比较，*Ｐ＜0.05。

2.2 miR-199b-5p对C1GALT1蛋白水平的影响 瞬转miR-199b-5p mimic 后,C1GALT1蛋白水平下降( P<0.05)；瞬转miR-199b-5p inhibitor 后,C1GALT1表达升高(P<0.05)，见表2。

表2miR-199b-5p对C1GALT1蛋白水平的影响（`x±s）

注：与瞬转前比较*P＜0.05。

2.3miR-199b-5p对BGC-823细胞增殖能力影响 miR-199b-5p mimic 24、48、72h后细胞增殖显著高于空白对照组(P<0.05)；miR-199b-5pinhibitor 24、48、72h后细胞增殖显著低于对照组(P<0.05),见表3。

与空白对照组对比*P＜0.05。

3.讨论

微小RNA（miRNA）作为一类非编码小RNA，在胃癌的发生发展中扮演着至关重要的角色。miR-199b-5p是一种在多种肿瘤中表达异常的miRNA，已有研究表明，它能够通过调控其靶基因的表达，影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为[5]。核心1β-1，3-半乳糖基转移酶（C1GALT1）作为糖基转移酶家族的重要成员，参与了多种细胞生理和病理过程。特别是在肿瘤中，C1GALT1的异常表达与肿瘤的恶性程度、侵袭能力及预后密切相关

本次研究显示，胃癌细胞中B4GALT3 表达高于正常胃粘膜(P<0.05)；瞬转miR-199b-5p mimic 后,B4GALT3 蛋白水平下降( P<0.05)；瞬转miR-199b-5p inhibitor 后,B4GALT3 表达升高(P<0.05)；分析原因：B4GALT3（β-1,4-半乳糖基转移酶3）是一种参与糖链合成的酶，在胃癌细胞中，B4GALT3的表达高于正常胃粘膜，提示B4GALT3与胃癌的发生或进展有关，可促进胃癌细胞的增殖、迁移或侵袭等恶性行为。miR-199b-5p是一种微小RNA（miRNA），通过与靶基因mRNA的3'非翻译区（3'UTR）结合来调控其表达，与B4GALT3的mRNA结合，并抑制其翻译或稳定性[6]。当瞬转（瞬时转染）miR-199b-5p mimic（模拟物）后，B4GALT3的蛋白水平下降，证实了miR-199b-5p对B4GALT3的负调控作用。当瞬转miR-199b-5p inhibitor（抑制剂）后，B4GALT3的表达升高，主要是由于inhibitor能够阻断miR-199b-5p的作用，从而解除对B4GALT3的抑制，降低B4GALT3的蛋白表达[7]。这些结果为进一步探索胃癌的发病机制和治疗靶点提供了新的思路。未来研究可以深入探索miR-199b-5p在胃癌中的调控机制，以及通过调控miR-199b-5p的表达来影响胃癌细胞行为的可行性。

本次研究显示，miR-199b-5p mimic 24、48、72h后细胞增殖显著高于空白对照组(P<0.05)；miR-199b-5pinhibitor 24、48、72h后细胞增殖显著低于空白对照(P<0.05)；分析原因：miR-199b-5p的过表达（通过mimic引入）促进了细胞的增殖。这可能是由于miR-199b-5p靶向并下调了与细胞增殖负相关的基因，miR-199b-5p的抑制（通过inhibitor引入）降低了细胞的增殖能力，主要是由于因为当miR-199b-5p的表达被抑制时，那些原本被它调控的基因表达发生了改变，从而影响了细胞的增殖[8]。miR-199b-5p的高表达通过调控与细胞迁移相关的基因，例如影响细胞骨架重排、细胞间粘附等过程的基因促进了细胞的迁移能力。miR-199b-5p下调了与细胞侵袭和转移相关的基因，或通过其他途径影响了细胞外基质的降解、细胞极性丧失等过程，抑制了细胞的侵袭能力。

综上所述，miR-199b-5p通过调控B4GALT3的表达，影响了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，为胃癌的治疗提供了新的潜在靶点。

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衡科发（2021）51号衡阳市指导性计划项目：miR-199b-5p调控核心1β-1，3-半乳糖基转移酶对胃癌细胞恶性行为的影响（2021033）