PER2在成人ITP巨核细胞异常凋亡中的作用

【摘要】 目的 探讨PER2在成人ITP患者巨核细胞异常凋亡中的作用。方法 通过收集初诊的ITP患者及正常对照组的外周血及骨髓涂片，进行资料统计分析、巨核细胞形态对比、免疫组化及Western-blot检测PER2在各组的表达情况。结果 与正常对照组相比，ITP组颗粒巨核细胞数目明显增高，而其产板巨核

细胞数目明显降低，且均有统计差异（P<0.01）；ITP组颗粒巨核细胞胞体边缘不规则，胞核大，染色质较疏松，胞浆偏蓝量较少，胞浆中的颗粒细小且稀疏；免疫组化显示ITP组颗粒巨核细胞内棕褐色颗粒明显减少；Wesrern-blot检测PER2在ITP组巨核细胞表达明显降低，具有统计学意义（P<0.05）。结论 生物钟基因PER2表达降低，引起巨核细胞凋亡异常，致使其质膜分化系统异常，最终发生血小板生成减少。

【关键词】 PER2；ITP；巨核细胞；凋亡；异常

The role of PER2 in abnormal apoptosis of adult ITP megakaryocytes

ZHOU Rongrong,CHEN Lanting,LIU Zhanshu△(Department of Hematology,The Affiliated Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University,Yongchuan Chongqing 402160,China)

【Abstract】 Objective Exploring the role of PER2 in abnormal apoptosis of megakaryocytes in adult ITP patients. Methods By collecting peripheral blood and bone marrow smears from newly diagnosed ITP patients and normal control group, data statistical analysis, comparison of megakaryocyte morphology, immunohistochemistry, and Western blot detection of PER2 expression in each group were conducted. Results Compared with the normal control group, the number of granulosa megakaryocytes in the ITP group was significantly increased, while their production of plate megakaryocytes was higher The number of cells significantly decreased and there were statistical differences (P<0.01); The ITP group's granular megakaryocytes have irregular cell body edges, large nuclei, loose chromatin, less bluish cytoplasm, and small and sparse granules in the cytoplasm; Immunohistochemistry showed a significant decrease in brown granules within the granulosa megakaryocytes of the ITP group; Wesrern blot analysis showed a significant decrease in PER2 expression in megakaryocytes in the ITP group, with statistical significance (P<0.05). Conclusion The decreased expression of the biological clock gene PER2 leads to abnormal apoptosis of megakaryocytes, resulting in abnormal plasma membrane differentiation system and ultimately reduced platelet production.

【Key words】  PER2; ITP; Megakaryocytes; Apoptosis;Abnormal

原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenic,ITP）是获得性自身免疫性疾病[1-2]，虽有新药的不断问世，但仍近1/3的成人ITP患者无有效的治疗手段，多数转变为慢性或难治性ITP。ITP患者因出血风险大、疾病转归的不可预测、对疾病的恐惧感、长时间的治疗、社会活动减少等各种因素严重影响其生活质量[3]，而影响患者生活质量的因素主要包括恐惧、焦虑、抑郁、烦躁等，在成人 ITP 患者中最突出的表现是抑郁症和焦虑症发病率明显增高[4-5]，其原因与与其血小板数目及严重程度密切相关[6]，而焦虑、抑郁易导致作为一种内源性计时机制的昼夜节律发生紊乱，其深层次机制是CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、CRY1、CRY2等生物钟基因发生改变[7]，其中PER2存在巨核细胞中[8]，且对促进巨核细胞分界膜系统发育成熟产生血小板至关重要，而非影响巨核细胞数目或巨核细胞DNA增殖[9]。因此，从生物钟基因研究ITP的发病机制为ITP患者的治疗提供新的视角。

1  材料与方法

1.1  临床数据及标本收集：收集2022年1月-2023年12月在重庆医科大学附属永川院血液内科住院的ITP初诊患者50例作为ITP组，全部符合2009年国际工作组制定的ITP诊断标准[10]，其中男19例，女31例，年龄跨度41～70岁，中位年龄65岁，采集的上述标本骨髓进行涂片，同时采集外周血20ml/份，5%EDTA抗凝。采集标本前均未使用过强的松或其它免疫抑制剂。正常对照组为22名健康志愿者,其中男8例, 女14例，年龄跨度41～68岁，中位年龄62岁，经伦理委员会同意并患者签署知情同意书，采集的上述标本外周血20ml/份，5%EDTA抗凝。同时收集22例骨髓及血象均无异常的骨髓涂片作为正常对照组,其中男10例,女12例，年龄跨度39～70岁，中位年龄63岁。上述各组外周血室温离心（3000g，30分钟），吸取上层少血小板血浆，用1.5ml无菌塑料EP管的分装后-80℃冰箱保存于重庆医科大学附属永川医院中心实验室备用。

1.2  骨髓涂片染色剂检查方法  选取ITP患者及正常对照组厚薄均匀一致的骨髓涂片，待骨髓涂片自然干燥后将其置于染色架上，滴加适量Wright-Giemsa 染液覆盖骨髓涂片，室温染色1～2min，涂片滴加等量磷酸盐缓冲液，应用洗耳球轻轻吹打，使磷酸盐缓冲液与Wright-Giemsa染液混匀，室温静置10～15min，用自来水从玻片一端轻轻冲洗，干燥，取染色良好的骨髓涂片镜检：先用低倍镜观察染色情况，再用油镜仔细观察，油镜下进行巨核细胞计数和分类，每片计数25个巨核细胞，分别对两组的颗粒巨核细胞和产板巨核细胞进行统计分析，同时对ITP组及正常对照组的颗粒巨核细胞在油镜下拍照。

1.3  免疫细胞化学检测  骨髓涂片置于60℃烘箱中，烘2小时后骨髓涂片放入4%多聚甲醛中固定20min，PBS冲洗3分钟×3次，通透剂室温20min，PBS冲洗3分钟×3次，3%FBS(30ul FBS+1ml PBS)室温封闭30min，滴加鼠抗人PER2一抗稀释液（1:300）覆盖骨髓涂片，室温孵育60分钟或4℃孵育过夜，PBS冲洗3分钟×3次，滴加反应增强液，滴加适量的反应增强液，室温孵育20min，PBS冲洗3分钟x3次，滴加适量的增强酶标羊抗鼠1gG聚合物，37℃孵育20min，PBS冲洗3分钟×3次，加入适量新鲜配制的DAB显色液，室温孵育5分钟，自来水冲洗，苏木素染色30s，自来水冲洗30s，酒精分化3s，自来水冲洗30s；碳酸锂返蓝5s，自来水冲洗30s，吹风机吹干后中性树胶封片。结果判定：细胞观察到棕黄色即为阳性。

1.4  Western blot检测PER2蛋白表达量  选用Meg-01细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，另加100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，于37℃、5 %CO2的饱和湿度的孵箱中培养，2-3d换液传代1次。实验分组：正常对照组：Meg-01细胞与正常对照组血浆共培养；ITP组：Meg-01细胞与ITP患者血浆共培养。取对数生长期细胞进行实验，每组收集1×107个以上细胞，用预冷的PBS洗涤3次，3000 r/min，5min后，弃上清，然后按照蛋白提取试剂盒说明进行操作，最终得到蛋白提取物。用BCA法测定蛋白浓度，取总蛋白30μg，算出每组的上样量后加入配好的10%SDS-PAGE进行凝胶电泳（浓缩胶：60 V，30 min；分离胶：100 V，1 h）分离目的蛋白；然后在250 mA，1 h条件下将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用含5g脱脂奶粉的TBST 100mL，室温封闭2h; 分别加1:200稀释的鼠抗人PER2抗体，4℃孵育过夜，用TBST漂洗10 min×3次；加1:3000 稀释的过氧化物酶结合的二抗,室温孵育2 h; 用TBST漂洗10 min×3次,然后进行ECL发光，用凝胶图像分析仪曝光拍照。将硝酸纤维素膜用洗脱液漂洗1h以去除上一次结合的抗体,再分别与1:500稀释的鼠抗人β-actin 抗体4℃孵育，漂洗，孵育二抗再漂洗后，扫描蛋白印迹条带。实验重复3次。采用Quantity One分析软件对目的蛋白条带进行灰度扫描，结果用目的蛋白/β-actin灰度值之比表示。

1.5  统计学分析：数据以x̄±s表示，所有数据采用单因素方差分析和两独立样本均数比较的t检验对各组进行数据统计，统计软件为SPSS 16.0。P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异非常显著。

2  结  果

2.1  ITP组与正常对照组骨髓涂片中巨核细胞数目的统计分析

如图1 A所示，ITP组巨核细胞总数与正常对照组相比，无统计学意义；如图1 B所示，与对照组比较，ITP组颗粒巨核细胞数目明显增高，且具有显著差异（P<0.01），而ITP组产板巨核细胞数目明显降低，也具有统计差异（P<0.05）。

图1 ITP组与正常对照组骨髓涂片中巨核细胞数目的统计分析. A: ITP组者与正常对照组骨髓涂片中巨核细胞总数的比较;B:ITP组与正常对照组骨髓涂片中颗粒巨核细胞及产板巨核细胞数目的比较(P<0.05或P<0.01).

2.2 ITP 组与正常对照组骨髓涂片中颗粒巨核细胞形态对比

颗粒巨核细胞在ITP组与正常对照组骨髓涂片中形态不同，ITP组颗粒巨核细胞胞体边缘不规则，胞核大，染色质较疏松，胞浆偏蓝量较少，胞浆中的颗粒细小且稀疏，而正常对照组颗粒巨核细胞胞体边缘相对整齐，细胞边缘成弥散状改变，胞核小，染色质致密，胞浆胞浆偏红量丰富，胞浆中的颗粒较粗大且浓密（见图2 A B）。

图2 A B  ITP组与正常对照组颗粒巨核细胞瑞氏染色形态对比（100×）

2.3  PER2在ITP 组与正常对照组骨髓涂片中巨核细胞的表达

在正常对照组巨核细胞内有明显的棕褐色颗粒，而在ITP组颗粒巨核细胞内棕褐色颗粒明显减少（见图3 A B）。

图3 A B 免疫组化检测PER2在 ITP 组与正常对照组巨核细胞的表达对比（100×）

2.4  Wesrern-blot检测PER2在 ITP 组与正常对照组巨核细胞的表达情况

如图4所示，PER2在ITP组蛋白灰度比值PER2/β-actin分别为（0.58±0.03），与对照组相应蛋白灰度比值（1.08±0.04）相比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。

图4  Wesrern-blot检测PER2在 ITP 组与正常对照组巨核细胞的表达情况

3  讨  论

目前观点认为 ITP 是自身抗体和（或）细胞毒 T 细胞（CTL）介导的血小板破坏过多及巨核细胞血小板生成不足双重打击下的自身免疫性出血性疾病[11]。ITP患者的生活质量低下备受关注，尤其是成人ITP，研究发现ITP患者的生活质量低下水平与其血小板计数呈正相关，其机制可能与生物钟基因改变密切相关，因此我们选取PER2基因作为靶点进行研究对巨核细胞生成血小板的影响，首先我们的结果显示成人ITP患者的颗粒巨核细胞胞体皱缩，细胞边缘整齐，胞浆量较少，胞浆中的颗粒细小且稀疏，而正常对照组颗粒巨核细胞胞浆量丰富，细胞边缘成弥散状改变，胞浆中的颗粒较粗大且浓密，这与Wang Qi等报道的巨核细胞伪足状前血小板结构的形成均受限影响其后续血小板成熟和释放，即影响巨核细胞质膜分化系统异常相符[12]。我们通过免疫组化显示PER2在成人ITP患者巨核细胞表达明显降低，Western blot也提示PER2蛋白在成人ITP组巨核细胞表达明显降低。巨核细胞是通过凋亡过程产生血小板的，其质膜分化系统异常与凋亡异常时密切相关的，而PER2的降低或缺失会导致巨核细胞质膜分化系统异常[9]，因此我们推测ITP患者生活质量低下影响其生物钟基因PER2表达降低，引起巨核细胞凋亡异常，致使其质膜分化系统异常，最终发生血小板生成减少。

参考文献

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基金项目：重庆市永川区科技局自然科学基金项目（2021yc-jckx20029）、重庆医科大学附属永川医院院内科研课题资助项目（YJJC202013）