多重PCR技术在食品致病菌同步筛查中的检验应用

【摘要】目的：分析在食品致病菌同步筛查中应用多重PCR技术的检验效果。方法：采集320份样品，包括市售生鲜肉、乳制品、即食凉菜，同步筛查中使用多重PCR技术、国标分离培养法。结果：体系特异性100.00%，灵敏度提升10倍以上。有45份多重PCR阳性样品，同步检出36份国标培养，两种方法一致性Kappa=0.862。生鲜畜禽肉致病菌的污染风险最高。结论：在食品致病菌同步筛查中应用多重PCR技术的检验效果理想，特异性和灵敏度均高，结果基本一致于国标分离培养法，应用价值高。

【关键词】多重PCR技术；食品致病菌；同步筛查；检验

公共卫生安全的核心环节是食品安全，诱发食品中毒、食品安全事故的主要诱因是食源性致病菌污染，民众身体健康、食品行业健康发展受到严重威胁。在生鲜肉、乳制品、即食凉菜中高频检出的高风险菌株包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等4种致病菌[1]，是食品安全筛查的重点管控对象。目前常用致病菌检测手段是国标分离培养法，但有检测周期长、操作繁琐、仅可单一菌株检测等不足，不能对大批量食品快速同步筛查需求进行有效满足。临床研究多重PCR技术，依托特异性引物同步扩增检测多种致病菌基因[2]，检测优势是高效、精准、高通量，可在微生物检测领域中广泛应用。为了分析在食品致病菌同步筛查中应用多重PCR技术的检验效果，选取320份样品进行数据研究。

1 资料和方法

1.1资料

选取四种高风险食源性致病菌标准菌株，包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希氏菌O157:H7，采集320份样品，来源于2025年1-12月，包括市售生鲜猪肉80份、生鲜牛肉80份、巴氏鲜奶60份、凉拌熟食100份。

1.2方法

设计各菌特异性靶基因引物，沙门氏菌靶基因invA、扩增片段长度570bp，金黄色葡萄球菌nuc、320bp，单增李斯特菌iap、440bp，大肠埃希菌O157:H7stx1、210bp，退火温度一致，均为58℃。

将多重PCR反应体系与扩增参数优化，2×PCR Mix12.5μL，4对上下游引物各0.5μL（10μmol/L），模板DNA 2μL，无菌去离子水补足到25μL。扩增程序：95℃环境下预变性5min，95℃环境下变性30s，58℃环境下退火40s，72℃环境下延伸40s，35个循环，72℃环境下终延伸8min，4℃环境下保存。电泳使用1.5%琼脂糖凝胶，120V电泳30min。

特异性试验中有4种非目标阴性对照菌基因组DNA和4种目标菌，加入多重PCR体系扩增，灵敏度试验中稀释4种致病菌菌液梯度为2.106～100CFU/mL，将DNA提取，进行多重PCR，同步梯度稀释基因组DNA（5ng/μL-5×10-5ng/μL）。

同步筛查中使用多重PCR技术、国标分离培养法：（1）25g样品混合225mL BPW增菌液，在36℃环境下对其振荡增菌，时间4h，使用试剂盒提取DNA，使用多重PCR扩增电泳；（2）首先分菌种单独增菌，然后选择性平板分离，最后生化鉴定，72h后判定。

统计体系特异性、灵敏度、多重PCR和国标培养的一致性，统计不同食品致病菌阳性检出率。

2 结果

2.1特异性检测结果

多重PCR扩增结果提示仅4种目标致病菌扩增出570bp、320bp、440bp、210bp的单一清晰条带，体系特异性100%。

2.2灵敏度检测数据

4种致病菌的菌液最低检出浓度是10CFU/mL，体系最低稳定检出DNA浓度10pg/μL，灵敏度提升10倍以上。

表1 灵敏度检测结果

2.3两种检测方法比较

有45份多重PCR阳性样品，同步检出36份国标培养，两种方法一致性Kappa=0.862。

表2 两种检测方法比较

2.4不同食品致病菌阳性检出率

生鲜畜禽肉致病菌的污染风险最高。

表5 不同品类食品致病菌阳性检出分布

3 讨论

本研究同步筛查320份市售食品，对比4种常见食源性致病菌实施多重PCR与国标分离培养法的结果，多重PCR体系特异性100.00%，4种目标菌株均可将对应特征条带扩增出，证实本实验选择的四组引物特异性良好，退火温度相同，扩增条件统一，操作流程简化，可有效避免多温度梯度扩增技术导致实验误差，与批量样品同步检测需求适配[3]。灵敏度试验结果确定该体系菌液最低检出限10CFU/mL，检出DNA阈值10pg/μL，对比传统培养法，灵敏度提升10倍以上，可有效检出低载菌量污染样品，漏检风险降低。

两种检测方法一致性高，Kappa值0.862，证实两种检测在结果上高度吻合，本文研究中，多重PCR阳性45份较国标培养36份多，原因是后者需进行长时间增菌、分离纯化与生化鉴定等操作，部分致病菌受损或者处于活的非可培养状态，不能复苏形成菌落，假阴性容易发生[4]，多重PCR可将菌株核酸直接扩增，菌体活性不会对其造成限制，有更为广泛的检出范围。同时多重PCR单份检测时间不长，在6h，可一次性对4种致病菌进行同步检测，耗材成本低，而国标法单批次仅仅可对单一菌种检测，耗时72～96h[5]，市场大批量食品应急抽检中不建议应用。

样品污染数据提示，生鲜猪肉、牛肉污染风险较乳制品与即食凉菜高，分析得出，畜禽屠宰环节容易将沙门氏菌、单增李斯特菌携带，管控加工、运输环节不到位，交叉污染容易出现，巴氏鲜奶与凉拌熟食阳性率不高是因为主要污染菌是金黄色葡萄球菌，在管控方面，加工熟食人员的手卫生环节、乳制品杀菌环节有漏洞。

综上，在食品致病菌同步筛查中应用多重PCR技术的检验效果理想，特异性和灵敏度均高，结果基本一致于国标分离培养法，应用价值高。

参考文献：

[1]宋秋坤,张璐,李双,等. 2020—2025年平顶山市售食品致病菌污染状况及快速定量风险评估[J].微生物学免疫学进展,2026,54(3):80-86.

[2]张晓燕,李杰尊,罗海燕,等. 液相色谱技术在食品致病菌快速检测中的应用[J].食品安全导刊,2026,20(6):105-108.

[3]宋阿帅,曹月. 基于16S rDNA高通量测序的保健食品致病菌群落分析[J].食品安全导刊,2026,20(2):81-84.

[4]吴曙霞,牛记者,郑孟婷,等. 基于荧光定量PCR的食品致病菌快速检测技术研究[J].中国食品工业,2025,(23):83-85.

[5]赵家儒,张冰玉. 食品中特定致病菌的快速识别与定量生物检测技术[J].中外食品工业,2025,(4):58-60.