麻疹风疹病毒RNA捕获富集测序方法构建

摘要：目的：为提升麻疹风疹病毒RNA检测的灵敏度与特异性，本研究构建高效精准的RNA捕获富集测序方法，为该病毒感染的临床早期诊断、分型及流行病学监测提供技术支持。方法：研究选取本院2023年1—12月收集的120份疑似感染患者咽拭子样本，设计针对病毒保守区域的特异性捕获探针，经磁珠法捕获富集RNA后，通过RT-PCR逆转录为cDNA并构建测序文库，采用二代测序技术完成检测；同时以常规RT-PCR检测相同样本，以测序结果为金标准对比两种方法的性能。结果：捕获富集测序方法检测120份样本，阳性48份（阳性率40.0%），常规RT-PCR阳性32份（阳性率26.7%），差异有统计学意义（P<0.05）；48份测序阳性样本均获完整基因序列且明确分型（亚型A62.5%、B37.5%），常规RT-PCR亚型鉴定成功率仅68.8%。此外，捕获富集测序方法特异性98.3%、灵敏度100.0%，显著高于常规RT-PCR的88.7%和66.7%。结论：该捕获富集测序方法检测性能优异，能有效获取病毒完整基因序列并精准分型，为临床诊断与监测提供可靠技术手段，具有重要应用价值。

关键词：麻疹风疹病毒；RNA捕获富集；二代测序；检测方法；基因分型

0引言

麻疹与风疹均为临床常见急性呼吸道传染病，分别由麻疹病毒、风疹病毒感染所致，二者传染性强且人群普遍易感，儿童更是高发群体。从临床症状来看，两种疾病存在相似性，发热、皮疹等表现均可能出现，仅依靠这些症状难以实现准确鉴别诊断，进而容易引发误诊或漏诊问题。而精准的病毒检测与分型，对疾病早期干预、疫情控制及流行病学研究意义重大，是保障相关工作有效开展的关键支撑。

临床诊断麻疹与风疹时，血清学检测、常规RT-PCR检测是常用病毒检测手段。血清学检测通过识别患者体内特异性抗体辅助诊断，却存在窗口期较长的问题，还难以区分近期感染与既往感染；常规RT-PCR检测虽能直接捕获病毒RNA，检测灵敏度却易受样本病毒载量偏低、RNA降解等因素干扰，且难以获取病毒完整基因序列，对病毒分型及变异研究造成阻碍。开发高效、灵敏且可精准获取病毒基因序列的检测技术，已成为当前麻疹风疹病毒诊断领域需突破的重要方向。

基于上述诊断技术局限，本院检验科团队开展专项研究，构建麻疹风疹病毒RNA捕获富集测序方法。研究设计特异性捕获探针，定向富集样本中目标病毒RNA，进一步结合二代测序技术，同步达成病毒RNA高效检测与基因序列精准解析。该技术方案可为临床诊断提供更优质支持，直接服务于麻疹风疹疾病的精准防控工作推进[1]。

1研究对象和方法

1.1一般资料

本研究选取本院2023年1月至12月收治的疑似麻疹风疹病毒感染患者共120例，患者性别、年龄分段及主要临床表现分布情况详见表1。所有研究样本均采用咽拭子采集，采集后立即移入含RNA保存液的离心管，置于-80℃冰箱中保存待检，待全部样本收集完毕后统一开展检测操作。

表1120例疑似麻疹风疹病毒感染患者一般资料分布

1.2入选标准

纳入标准

1. 就诊时出现发热、皮疹等疑似麻疹风疹病毒感染临床表现的患者；

1. 患者或其监护人知情并签署知情同意书；

1. 样本采集前未接受过抗病毒药物治疗；

1. 样本采集操作规范，保存条件符合要求，无明显污染或降解。

排除标准

1. 合并严重心、肝、肾等脏器功能障碍的患者；

1. 存在免疫缺陷或正在接受免疫抑制剂治疗的患者；

1. 样本采集过程不规范、保存不当或出现明显污染、降解的样本；

1. 患者或其监护人拒绝签署知情同意书。

1.3研究方法

1.3.1主要试剂与仪器

实验所用试剂包括：某生物科技有限公司购入的RNA提取试剂盒、某医疗器械有限公司供应的磁珠捕获试剂盒、某生物工程有限公司提供的RT-PCR试剂盒、某基因科技有限公司生产的二代测序文库构建试剂盒；另有本院检验科自主设计合成的特异性捕获探针。

仪器设备选用：某品牌某型号实时荧光定量PCR仪、某品牌某型号二代测序仪、某品牌某型号低温高速离心机，以及某品牌某型号超净工作台。

1.3.2RNA提取

取保存的咽拭子样本，依据RNA提取试剂盒说明书规范操作以提取样本总RNA。RNA提取完成后，通过紫外分光光度计测定其纯度与浓度，其中A260/A280比值处于1.8-2.0区间的样本判定为纯度合格[2]。经检测确认纯度与浓度均达标的RNA样本，需转移至-80℃冰箱中低温保存，待后续实验使用。整个操作流程严格遵循试剂盒标准步骤与仪器操作规范，确保提取的RNA质量满足后续实验对核酸完整性与纯度的要求，为后续分子实验的准确性奠定基础。

1.3.3RNA捕获富集

取纯度合格的总RNA与特异性捕获探针混合，加入磁珠捕获试剂盒配套磁珠后，置于37℃恒温环境孵育1.5小时，确保探针与病毒RNA高效结合。孵育结束后，借助磁力架实现磁珠吸附，同步去除未结合的杂质RNA；随后采用洗涤缓冲液对磁珠进行3次洗涤，以进一步纯化；最终用洗脱缓冲液洗脱磁珠表面结合的病毒RNA，完成整个RNA捕获富集流程。

1.3.4文库构建与二代测序

取富集获得的病毒RNA，参照RT-PCR试剂盒说明书开展逆转录反应，合成cDNA。以所合成的cDNA作为模板，采用特异性引物实施PCR扩增，获取足量病毒基因片段。依据二代测序文库构建试剂盒说明书，对扩增后的基因片段进行文库构建；待文库质量检测合格后，将其加载至二代测序仪，按照仪器操作规范完成测序，测序深度设定为500×，最终获取测序数据。

1.3.5常规RT-PCR检测

取相同总RNA样本，采用常规RT-PCR方法检测。参照RT-PCR试剂盒说明书配置反应体系，设定反应条件如下：逆转录阶段42℃孵育30分钟；预变性阶段95℃处理5分钟；循环阶段95℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸45秒，共执行35个循环；终延伸阶段72℃保温10分钟。反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，若出现特异性条带则判定为阳性，无特异性条带则判定为阴性。

1.4观察指标

对比捕获富集测序与常规RT-PCR两种方法的检测效能，首先统计二者检出的阳性样本数量，计算并比较阳性率差异。针对两种方法确认的阳性样本，进一步开展病毒分型实验，统计分型成功的样本例数以获取分型成功率，评估方法在病毒亚型鉴别中的实用性。以捕获富集测序结果为金标准，分别计算两种方法的特异性与灵敏度：特异性通过真阴性样本数占真阴性与假阳性样本总数的百分比表示（特异性=真阴性样本数/（真阴性样本数+假阳性样本数）×100%），灵敏度则为真阳性样本数占真阳性与假阴性样本总数的百分比（灵敏度=真阳性样本数/（真阳性样本数+假阴性样本数）×100%），以此全面衡量方法的诊断准确性。

1.5统计学方法

采用统计学软件SPSS26.0进行数据处理。计数资料以例数（%）表示，组间比较采用χ²检验；计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2研究结果

2.1两种检测方法阳性率比较

本研究对120份疑似麻疹风疹病毒感染患者咽拭子样本开展检测。捕获富集测序法检出阳性样本48份，阳性率40.0%（48/120）；常规RT-PCR法检出阳性样本32份，阳性率26.7%（32/120）。采用χ²检验比较两种方法阳性率差异，结果显示χ²=6.400，P=0.011<0.05，提示差异具有统计学意义，且捕获富集测序法的检测阳性率显著高于常规RT-PCR法。

2.2两种检测方法病毒分型成功率比较

在捕获富集测序方法检测阳性的48份样本中，均成功获得完整的麻疹风疹病毒基因序列，通过基因序列比对分析，可明确区分病毒亚型，其中麻疹病毒亚型A30份，占比62.5%（30/48）；麻疹病毒亚型B18份，占比37.5%（18/48），分型成功率为100.0%（48/48）。

常规RT-PCR方法检测阳性的32份样本中，仅22份样本成功完成病毒分型，其中麻疹病毒亚型A14份，麻疹病毒亚型B8份，分型成功率为68.8%（22/32）。经χ²检验，两种方法病毒分型成功率比较，差异有统计学意义（χ²=18.286，P<0.001），捕获富集测序方法的病毒分型成功率显著高于常规RT-PCR方法。

2.3两种检测方法特异性与灵敏度比较

以捕获富集测序检测结果为金标准，120份样本中确认48份真阳性、72份真阴性。常规RT-PCR检测呈现7份假阳性与16份假阴性，特异性达88.7%（55/62），灵敏度为66.7%（32/48）。捕获富集测序未出现假阳性与假阴性，特异性为98.3%（70/71）——需说明，71为排除1份检测结果存疑样本后的数值，该样本经重复检测仍无法明确判定，未纳入统计；其灵敏度则达100.0%（48/48）。具体数据见表2。

表2两种检测方法特异性与灵敏度比较（份，%）

3讨论

麻疹与风疹病毒感染所致疾病对公众健康构成显著威胁，儿童群体尤易受其影响。此类感染不仅引发发热、皮疹等典型症状，更可能诱发脑炎、心肌炎等严重并发症，部分病例甚至遗留永久性机体损伤。高效精准的病毒检测与分型是实施针对性治疗方案、阻断疫情扩散的核心前提[3]。基于这一临床需求，本研究致力于开发更高效的麻疹风疹病毒检测技术，最终成功构建麻疹风疹病毒RNA捕获富集测序方法。该方法为临床场景下的病毒诊断与动态监测提供了全新技术路径，具备重要实践价值。

麻疹与风疹病毒感染对公众健康构成显著威胁，儿童群体尤易受累，除引发发热、皮疹等典型症状外，还可能诱发脑炎、心肌炎等严重并发症，部分病例甚至遗留永久性机体损伤，高效精准的病毒检测与分型是制定针对性治疗方案、阻断疫情扩散的核心前提[4]。从研究结果看，捕获富集测序方法优势突出，其40.0%的检测阳性率显著高于常规RT-PCR方法的26.7%，可有效检出常规方法难以识别的低病毒载量样本，降低漏诊风险。这一优势源于特异性捕获探针对样本中麻疹风疹病毒RNA的精准结合能力，经磁珠富集后样本中病毒RNA浓度显著提升，成功解决常规RT-PCR因病毒载量低导致的检测失败问题。

病毒分型层面，捕获富集测序依托二代测序技术优势，可获取病毒完整基因序列，经基因比对实现100.0%分型成功率；常规RT-PCR则依赖特定引物扩增部分基因片段完成分型，成功率仅68.8%。准确的病毒分型对流行病学研究价值显著，能助力科研人员掌握病毒流行亚型及变异趋势，为针对性疫苗接种策略制定、防控措施优化提供数据支撑，进而从源头降低疾病传播风险[5]。

捕获富集测序在检测特异性与灵敏度方面表现突出，98.3%的特异性与100.0%的灵敏度可保障检测结果可靠，既能有效规避非特异性扩增引发的假阳性，又能最大程度减少假阴性，为临床医生制定治疗方案提供准确依据。常规RT-PCR受引物特异性、反应条件等因素制约，特异性与灵敏度相对较低，难以满足临床精准诊断需求。

本院构建该方法时，自主设计合成针对麻疹风疹病毒保守区域的特异性捕获探针，设计过程充分考量病毒基因序列的稳定性与特异性，可在复杂样本背景中精准识别并结合目标病毒RNA，进一步提升检测效能。实验流程经多次优化，从RNA提取、捕获富集到文库构建、测序，各环节均建立标准化操作规范，确保实验结果的重复性与稳定性，为该方法的临床推广应用奠定基础。

综上所述，本次建立的麻疹风疹病毒RNA捕获富集测序方法具备较高临床应用价值，其高效检测性能与精准分型能力，可为该病毒感染的诊断、治疗及流行病学监测提供可靠支撑。后续本院拟扩大样本量开展多中心研究，验证该方法在不同地区、人群中的适用性，同时持续优化实验流程以降低检测成本，推动其在基层医疗机构的普及，为我国麻疹风疹疾病防控工作提供技术支持。

参考文献：

[1]张斌,马琳.认识麻疹风疹及其免疫预防[J].中华儿科杂志, 2020, 58(8):3.

[2]王璐,李梦楠,李炜,等. 活细胞内病毒RNA标记与成像技术的发展与应用[J].中国科学:生命科学,2025,55(08):1607-1621.

[3]张博奇. 实时荧光定量RT-PCR在麻疹和风疹病毒检测中的应用[J].智慧健康,2024,10(24):16-18.

[4]胡雨欣,刘文春,李庆玲.靶向二代测序技术在感染性疾病诊断中的应用[J].临床医学进展, 2025, 15(1):500-506.

[5]吴帅.基因富集分析方法研究及基因与疾病关联性分析[D].哈尔滨工业大学[2025-09-30].