地中海贫血筛查与基因型相关性研究分析

摘要：目的 研究分析地中海贫血筛查与基因型相关性。方法 自本院2025年1月-2025年12月期间行地中海贫血初筛异常的产妇中抽取300例作为研究对象均进行PCR+膜杂交法基因检测，将初筛检测结果与最终基因分型结果进行对比，以基因检测结果为标准，分析初筛指标与基因分型的相关性。结果 300例行地中海贫血初筛异常的产妇中，经基因检测确诊地贫有42例异常患者，在不同筛查方式的诊断结果中，血常规准确度、灵敏度及特异度为76.67%、50.00%、83.33%，血红蛋白电泳为76.33%、51.67%、82.50%，PCR+膜杂交法为94.00%、70.00%、100.00%，PCR+膜杂交法诊断准确度、灵敏度及特异度均高于其他筛查方式；在42例地中海贫血产妇中，共有α-地贫患者18例（占比42.86%），其中-α3.7/αα基因型最多，12例（占比66.67%），与其他基因型发生率比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其次为--SEA/αα基因型4例（占比22.22%）、-α4.2/αα地贫基因型2例（占比11.11%）；共有β-地贫患者24例(占比57.14%)，其中β-CD41-42位点突变基因杂合突变最多，10例（占比41.67%），与其他基因型发生率比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，其次为β-IVS-II-654基因杂合子基因型7例（占比41.67%）、β-CD17位点突变基因杂合子基因型5例（占比20.83%）、β-CD43突变基因杂合子基因型1例（占比4.17%）、β-E位点突变基因杂合子基因型1例（占比4.17%）。结论 采取科学有效的地中海贫血筛查方式，不仅提高筛查的准确度，还有助于分析其流行病学特点，有助于开展地中海贫血防控工作，防止中重型地贫患儿的出生，提升区域出生人口素质，减少家庭、社会的负担。 

关键词：地中海贫血；产前筛查；全自动血红蛋白电泳法；PCR+膜杂交法

地中海贫血是一类遗传性溶血性疾病，其核心病理机制在于珠蛋白基因缺陷致使特定珠蛋白链的生物合成速率下降，由此引发不同肽链之间的产量失衡，部分肽链生成不足而另一部分则呈相对过剩状态，这种珠蛋白肽链数量的不对称最终导致红细胞破坏加速[1]。依据受累珠蛋白链的种类差异，该病可划分为两大主要类型，因α-珠蛋白链合成减少或完全缺失所致的α-地贫，以及因β-珠蛋白链合成减少或完全缺失所致的β-地贫。该病在我国南方地区呈现显著流行特征，广东、广西、海南、贵州、云南、四川、重庆、台湾北部等省份均为高发区域，其中重庆地区人群基因携带率超过4%[2]。地中海贫血的防控体系中，基因检测居于核心枢纽地位。借助该项技术，可于妊娠早期准确判定夫妇双方的地贫基因突变基因型别，并依据常染色体隐性遗传病遗传定律联合产前诊断技术，从源头上阻断地贫基因缺陷的垂直传递，从而显著降低重型地贫患儿的出生风险，切实起到预防出生缺陷的作用，对促进区域人口优生优育及社会人口健康的可持续发展具有深远意义。本文现开展地中海贫血筛查与基因型相关性研究，为指导优生优育，减少中重型地贫患儿出生，降低区域中重型地贫发病率提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2025年1月-2025年12月期间的300例的地中海贫血筛查产妇，最小16岁，最大46岁，均值（31.33±3.73）岁。所有产妇上述资料对比结果符合统计学要求，P＞0.05。

纳入标准：①具备一定文化程度；②能够理解且配合度良好；③均为单胎妊娠。

排除标准：①合并其他贫血疾病；②患有精神疾病或既往病史；③因先天或后天疾病导致沟通困难。

1.2 方法

对照组：地中海贫血常规初筛检查，使用EDTA抗凝真空管采集静脉血2-3mL，并在采集后2 h内及时送检，需保存时置于2~8℃环境。①血常规：采用全自动血液分析仪检测，若平均红细胞体积（MCV）检测结果<82fL，平均红细胞血红蛋白含量（MCH）检测结果<27 pg，判定为血常规筛查异常。②血红蛋白电泳：采用全自动血红蛋白电泳法分析血红蛋白组分，血红蛋白电泳分析时,出现HbA2<2.5%或HbA2>3.5%时，血常规及血红蛋白电泳中任意一项异常即纳入初筛异常。

实验组：对上述初筛异常结果样本进一步行地贫基因分型检测，检测方法为PCR+膜杂交法检查。（1）标本采集：采用EDTA抗凝真空管采集2mL静脉血，采集好的血液标本立即送检，若暂不送检则需妥善保存，4℃环境内保存时间＜3d，检验前对血液保本进行DNA分离提取，取血液200μ1,以14000g离心10分钟，弃上清液后，建议采用QIAamp DNA Blood Mini Kit抽提DNA,具体操作步骤详见试剂盒说明书，提取DNA浓度20~40ng/μl,OD260/OD280的值在1.5~2.5之间。（2）PCR+膜杂交法：①将抽提完成的DNA产物取3~6μl作为模板纳入PCR反应体系实施体外扩增，未耗用的DNA余量置于-20℃低温环境中冻存以供后续实验使用。②α-地贫扩增试剂准备：α-地贫PCR MIX自试剂盒取出后于室温条件下完全溶解，经旋涡振荡充分混匀并以8000rpm离心1分钟处理；α-地贫DNA聚合酶同样自试剂盒取出后以8000rpm离心1分钟。依据每份43.5μl α-地贫PCR MIX与0.5μl α-地贫DNA聚合酶的单人标准配比方案，本研究共需配制13050μl α-地贫PCR MIX与150μl α-地贫DNA聚合酶，二者合并后充分混匀并再次以8000rpm离心1分钟，随后将上述混合扩增试剂按每管44μl的体积分配至预设的n个PCR反应管中。③β-地贫扩增试剂准备：β-地贫PCR MIX自试剂盒取出后于室温条件下充分溶解，经旋涡振荡混匀并以8000rpm离心1分钟；β-地贫DNA聚合酶与UNG酶自试剂盒取出后同样以8000rpm离心1分钟处理。依据每份46.5μl β-地贫PCR MIX、0.4μl β-地贫DNA聚合酶及0.1μl UNG酶的单人标准扩增体系配比，本研究共需配制13950μl β-地贫PCR MIX、120μl β-地贫DNA聚合酶及30μl UNG酶，上述组分合并后充分混匀并以8000rpm离心1分钟，继而按每管47μl的体积将配制完成的扩增试剂分装至预设的n个PCR反应管中。④分别进行α-地贫及β-地贫扩增程序，选择GeneAmp PCR System 9700扩增仪，温度速率为4℃/sec。⑤杂交实验启动前需将杂交液预加温至42℃并于整个杂交过程中持续保持该温度环境。PCR产物首先于95℃条件下变性处理5~10min，随后转移至冰水浴中冷却不少于2min，继而置于42℃环境下进入杂交阶段。杂交孔中先行注入1ml经42℃预温的杂交液，覆以盖板孵育至少2min后启动泵体排空液体并关闭水泵。将经变性处理的PCR产物DNA溶液与0.8ml杂交液充分混合后滴加于薄膜表面，覆盖盖板于42℃条件下孵育30min，随后开启泵体执行导流杂交操作。杂交完成后，在42℃恒温条件下以经同等温度预温的WB1对膜进行3~4次冲洗，单次冲洗体积为0.8ml。⑥操作人员进入仪器温度修改界面，将杂交仪工作温度设定为25℃并予以确认。随后依次以0.5ml封阻液对膜实施两轮封闭处理，每轮封闭后均启动泵体排空液体并关闭水泵。待体系温度稳定于25℃(±3℃)区间时，注入0.5ml酶标液并孵育5min，之后开启泵体排尽全部液体，同时将仪器温度调整至36℃。以溶液A对膜进行4次充分冲洗，单次用量为0.8ml；继而滴加0.5ml NBT/BCIP溶液，覆以盖板于适宜条件下显色3~5min，显色结束后启动泵体排空显色液。随后以杂交液对膜执行3次洗涤，每次用量为1ml，并以2ml蒸馏水完成终末漂洗。关闭泵体后揭除压扣盖，移除分隔室，以镊子夹取杂交膜置于吸水纸上晾干，全部结果判读需在1小时内完成。⑦结果判定依据杂交膜条上蓝紫色斑点的显色情况进行综合判读,膜条全域未见蓝紫色斑点者判定为阴性；突变或缺失检测探针区域显色强度与对应正常对照探针相当且均呈现蓝紫色斑点时，该位点判定为地贫突变或缺失杂合子；仅突变或缺失检测探针区域呈现蓝紫色斑点而对应正常对照探针区域无显色者，该位点判定为地贫突变或缺失纯合子。

1.3 观察指标

（1）对比分析不同筛查方式的诊断效果，包括准确度、灵敏度及特异度，灵敏度以真阳性例数与真阳性和假阴性例数之和的比值表示；特异度以真阴性例数与真阴性和假阳性例数之和的比值表示；准确度以真阳性与真阴性例数之和占总数的比例表示[3]。

（2）地中海贫血基因型分布情况分析：统计42例异常患者中不同基因型的分布比例。

1.4 统计学处理

数据以软件SPSS26.0处理，卡方（χ2）检验计数资料（%）、t检验计量资料（），P＜0.05有差异。

2 结果

2.1不同筛查方式的诊断结果比较

根据最终基因检测结果，300例地中海贫血初筛异常的产妇中，有42例地中海贫血。在不同筛查方式的诊断结果中，血常规准确度、灵敏度及特异度为76.67%、50.00%、83.33%，血红蛋白电泳为76.33%、51.67%、82.50%，PCR+膜杂交法为94.00%、70.00%、100.00%，PCR+膜杂交法诊断准确度、灵敏度及特异度均高于其他筛查方式，P＜0.05，见表1。

表1 不同筛查方式的诊断结果比较（n=300，%）

2.2地中海贫血基因型分布情况分析

在42例地中海贫血产妇中，共有α-地贫患者18例（占比42.86%），其中-α3.7/αα基因型最多，12例（占比66.67%），与其他基因型发生率比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其次为--SEA/αα基因型4例（占比22.22%）、-α4.2/αα地贫基因型2例（占比11.11%）；共有β-地贫患者24例(占比57.14%)，其中β-CD41-42位点突变基因杂合突变最多，10例（占比41.67%），与其他基因型发生率比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，其次为β-IVS-II-654基因杂合子基因型7例（占比41.67%）、β-CD17位点突变基因杂合子基因型5例（占比20.83%）、β-CD43突变基因杂合子基因型1例（占比4.17%）、β-E位点突变基因杂合子基因型1例（占比4.17%），详见表2。

表1 地中海贫血基因型分布情况分析（%）

3 讨论

地中海贫血是一组由珠蛋白基因缺陷导致的遗传性溶血性贫血，其核心病理机制为血红蛋白合成异常引发的红细胞寿命缩短与慢性溶血，该病属于常染色体隐性遗传病，根据珠蛋白链合成受累的基因类型，主要分为α型和β型两大类[4]。我国目前积极开展地中海贫血预防工作，有效预防了中重型地贫患儿的出生，降低了地贫高发省市的中重型地贫发病率。

全自动血红蛋白电泳法基于不同血红蛋白组分在电场中迁移率的差异，可精准检测血红蛋白A、血红蛋白A₂及血红蛋白F的含量，并通过异常血红蛋白条带的识别，对地中海贫血进行初步分型[5]。PCR+膜杂交法是一种将聚合酶链式反应（PCR）技术与膜杂交技术有机结合的分子诊断方法，其基本原理为首先利用PCR技术对含有地贫基因突变位点的目标DNA片段进行体外高效扩增，随后将扩增产物与固定于膜上的特异性寡核苷酸探针进行杂交反应，通过检测杂交信号来判断受检者是否携带特定的地贫基因突变类型，从而实现对常见地贫基因突变位点的快速、准确检测[6]。本文研究发现，PCR+膜杂交法检测准确度、特异度及灵敏度均高于血常规及血红蛋白电泳，P＜0.05；在42例地中海贫血产妇中，共有α-地贫患者18例（占比42.86%），其中-α3.7/αα基因型最多，12例（占比66.67%），与其他基因型发生率比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)；有β-地贫患者24例(占比57.14%)，其中β-CD41-42位点突变基因杂合突变最多，10例（占比41.67%），与其他基因型发生率比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。血常规作为最基础的初筛工具，通过检测红细胞平均体积、红细胞平均血红蛋白含量及红细胞计数等指标，能够有效识别小细胞低色素性贫血表型，从而将地中海贫血携带者及患者从常规人群中初步分离，但该方法仅能反映红细胞形态改变，无法区分缺铁性贫血与地中海贫血等具有相似血象特征的疾病，其特异性存在固有局限。血红蛋白电泳作为第二层级的筛查手段，通过对各类血红蛋白组分进行分离与定量分析，可检出HbA2及HbF的异常升高，从而明确β型地中海贫血的携带状态及部分α型地中海贫血的特征性改变，该技术在一定程度上弥补了血常规无法定性的不足，但对于α型地中海贫血中常见的静止型携带者及部分HbH病患者，其血红蛋白电泳表型可完全正常或仅呈轻微异常，导致漏检风险依然存在，且无法对基因型进行精确判定。PCR+膜杂交法则从基因层面实现了对地中海贫血的精准诊断，其核心机制在于利用针对已知地中海贫血常见突变位点设计的特异性寡核苷酸探针，经PCR扩增靶基因片段后，通过膜杂交反应实现探针与突变序列的特异性结合，从而一次性检测多种已知点突变及缺失突变，该技术之所以能够显著提高诊断的准确度、灵敏度与特异度，根本原因在于其直接针对致病基因的分子缺陷进行检测，从源头上规避了表型检测中因个体差异、合并缺铁或其他血红蛋白病干扰所致的假阴性与假阳性结果，同时多重探针同步杂交的设计使得该方法在单次反应中即可覆盖多种突变类型，既保证了对罕见突变组合的检出能力，又通过严格的碱基配对原则确保了结果的高度特异性，相较于血常规、血红蛋白电泳等方法，PCR+膜杂交法在操作效率与检测覆盖面之间取得了更优的平衡，尤其适用于地中海贫血高发地区的大规模人群筛查与产前诊断场景[8]。

综上所述，研究以本院妇幼保健院备孕及产检人群为研究对象，采用血常规或血红蛋白电泳任意一项异常作为地贫初筛标准，对300例初筛异常者行PCR+膜杂交法基因检测，42例确诊为地中海贫血，提示常规地贫初筛假阳性率较高，特异性有限。初筛易受孕期缺铁、生理状态改变等因素干扰，易造成孕产妇不必要的心理焦虑与医疗资源浪费，结合妇幼保健院优生优育、精准产检的专科定位，本院服务人群均为有生育需求的重点人群，建议对院内备孕、产检人群直接开展地贫基因检测，省略常规初筛步骤，基因检测可精准检出静止型、轻型地贫携带者，及时开展遗传咨询与产前干预，有效降低重型地中海贫血患儿出生风险，更适配妇幼专科临床诊疗需求[9]。

参考文献

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[4]都猛,王陈.毛细管电泳技术用于地中海贫血携带者筛查的应用研究[J].现代妇产科进展,2025,34(1):52-54.

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[7]何城,彭韵霖,何勇均,等.川东北地区3089例育龄期人群地中海贫血基因筛查结果分析[J].西部医学,2024,36(9):1360-1364,1370.

[8]刘静,黄宏耀.湖北随州地区孕妇α-地中海贫血产前筛查及基因型分布特点研究[J].陕西医学杂志,2023,52(5):541-544,557.

[9]颜梅珍,刘小龙,王元白,等. 泉州地区育龄人群地中海贫血筛查的应用分析[J]. 中国实验血液学杂志,2024,32(6):1841-1847. 

项目名称:地中海贫血筛查与基因型相关性研究分析

项目编号:黔科计2024219