基于网络药理与GEO芯片的黄连酒炙前后生物碱变化对糖尿病治疗机制研究

摘要：目的：基于网络药理联合GEO数据的黄连酒炙前后生物碱变化对糖尿病治疗作用研究。方法：基于文献获取黄连酒炙前后具有显著性差异的生物碱类成分。使用SwissADME对成分进行药理参数评价，通过检索PharmMapper数据库等5个数据库收集差异成分的作用靶点。使用GeneCards数据库获得疾病靶点。通过Cytoscape软件构建酒炙黄连“差异成分-药物靶点”、“蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络”和“靶点-通路”网络图，根据网络拓扑结构筛选核心靶点。通过R软件对交集靶点和核心模块进行富集分析。采用GEO数据库验证核心靶点，采用分子对接验证差异成分和核心靶点的作用。结果：酒黄连差异生物碱成分通过AKT1、EGFR、MAPK14、NOS3、HSP90AA1、SRC、KDR等靶点作用于PI3K-Akt 信号通路、胰岛素抵抗通路等通路来发挥治疗糖尿病的作用。GEO数据库验证了部分核心靶点。分子对接结果显示，差异成分与核心靶点有很好的结合潜力。结论：本研究初步揭示了酒炙黄连生物碱成分通过多靶点、多通路止消渴的原理，为酒炙黄连止消渴炮制原理的完整阐明提供研究基础。

关键词：黄连酒炙；生物碱；网络药理；GEO芯片；分子对接；

糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，其全球患病率持续攀升，已成为21世纪重大公共卫生挑战。长期血糖控制不佳可导致多种严重并发症，包括心脑血管疾病、视网膜病变、肾病及神经损伤等，不仅严重影响患者生存质量，也给家庭和社会带来沉重的医疗与经济负担。因此，探索安全有效的糖尿病防治新策略具有重要意义[1]。

在传统中医理论中，消渴症与糖尿病临床表现相符。黄连作为常用清热燥湿药，其炮制品酒黄连历来被用于消渴治疗。现代研究显示，酒炙工艺可显著改变黄连中多种生物碱（如小檗碱、药根碱等）的含量，使其在调节糖脂代谢、改善胰岛素抵抗及保护胰岛β细胞方面表现出优于生品的活性[2,3]。本研究旨在运用网络药理学方法，系统分析酒炙前后黄连生物碱成分的变化，并探讨其多成分、多靶点、多通路协同治疗糖尿病的潜在机制，为中药炮制机制的现代阐释与临床应用提供科学依据。

材料与方法

数据库及软件

酒炙黄连差异成分ADME筛选

从《基于高分辨质谱数据库的黄连炮制前后生物碱变化规律》[2]获得酒黄连炮制前后含量出现显著差异的六种生物碱成分，将其导入SwissADME网站进行ADME筛选。以Lipinski规则为筛选标准，将通过筛选的成分纳入下一步分析。

酒黄连差异成分作用靶点的获得

将通过ADME筛选的差异成分分别输入到PharmMapper网站（Norm Fit≥0.6）、PubChem数据库（BioAssay, taxids=9606，acvalue≤100μmol)、TargetNet网站（Prob≥0.6）、Swiss Target Prediction网站（Probability≥0.15）按相应条件进行靶点预测和筛选，利用Uniprot数据库进行校正，将靶点名称转为基因名称。综合以上数据库所得到的靶点作为成分的相关靶点。

疾病靶点收集和交集靶点的获取

以“Diabetes Mellitus”“Diabetes”“DM”为关键词，在Genecards数据库中检索获得相关疾病靶点。为了获得交集靶点，将药物靶点和疾病靶点导入Venny在线网站获取交集靶点。

酒黄连“差异成分-交集靶点”网络的构建

为了可视化差异成分与交集靶点之间的关联，将差异成分及其相应靶点导入Cytoscape软件中，获得“成分-靶点”网络。

PPI网络的构建和分析

将交集靶点导入String平台中，建立PPI网络，再将PPI网络导入Cytoscape软件中，使其可视化。利用ClusterMaker中MCODE模块进行分解，获得PPI网络中的核心模块。

KEGG/GO通路富集分析

将交集靶点和核心模块的相关靶点导入R软件，使用R软件的ClusterProfiler GO和ClusterProfiler KEGG以p.adj<0.05 & qvalue<0.2为条件来分析GO和KEGG富集情况。

靶点-通路图的构建

选取与内分泌系统、内分泌与代谢疾病、免疫系统、脂类代谢、信号转导有关的KEGG通路、相关靶点、成分导入Cytoscape软件中，利用NetworkAnalyzer进行分析。

核心靶点的获得

根据网络的拓扑特征，以Degree of Degree Centrality(DC)在PPI网络和靶点-通路图筛选核心靶点[9]。将PPI网络核心靶点和通路核心靶点导入Venny在线网站获取交集，作为最终的核心靶点。

GEO数据库验证

从GEO数据库中下载GSE25724数据集，使用GEO2R工具，进行基因注释和表达量分析，以验证筛选出来的核心靶点。

分子对接验证

从PubChem中下载成分的SDF文件，导入Chem3D进行能量最小化处理。从RCSB 数据库中下载核心靶点的PDB文件，利用Autodock vina进行预处理，再将配体文件和蛋白文件导入Autodock vina -1.5.6进行分子对接验证。

结果

ADME筛选结果

从文献中获得巴马汀、表小檗碱、非洲防己碱、黄连碱、小檗碱、药根碱的ADME筛选见表1，其均满足Lipinski规则，故均纳入后续分析。

表1 六种生物碱ADME筛选结果

差异生物碱靶点、疾病靶点检索和交集靶点

从PharmMapper、PubChem、TargetNet、Swiss Target Prediction收集获得成分靶点114个。从Genecards中获得糖尿病靶点26864个。将两者导入Venny2.1.0后取交集，获得交集靶点85个。韦恩图见图1。

图1 交集靶点venny图

差异生物碱治疗糖尿病网络可视化分析

将化合物和交集靶点导入cytoscape3.7.1后生成一个有91个节点和408条边的网络，结果如图2。

图2 酒黄连差异生物碱治疗糖尿病网络图

交集靶点PPI分析

将交集靶点导入String数据库，将置信度设置为0.7，得到了一个有60个节点和145条边的网络图。见图3。从中可以看出HSP90AA1、AKT1、MAPK14、EGFR、ESR1、ESR2等为重要靶点。

图3 药物-疾病交集靶点蛋白互作网络图

KEGG/GO通路富集分析

GO功能富集分析包括生物学过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）三个部分。将交集靶点进行GO富集分析，富集得到623条BP通路、89条MF通路、20条CC通路。选取各项排名靠前的10条通路，绘制柱状图。见图4。

将交集靶点进行KEGG通路富集分析，富集得到41条KEGG通路，其中与糖尿病相关的通路有18条，主要涉及内分泌、免疫系统、信号转导、脂质代谢等多类型通路。结果见图5。

图4 交集靶点GO功能分析

图5 交集靶点KEGG通路分析

靶点-通路网络

将上述18条KEGG通路、交集靶点导入cytoscape3.7.1，根据degree值大小，显示通路和靶点对拓扑网络的影响，绘制图6。可以看出AKT1、SRC、EGFR、MAPK14、NOS3是重要的靶点，PI3K-AKT1信号转导通路是重要的靶点通路。

图6 靶点-通路图

核心靶点表

以两倍中位数Degree值为筛选标准，在蛋白互作网络和靶点-通路网络中筛选其网络所对应核心靶点，再将两个核心靶点集取交集作为最终的核心靶点，最终筛选7个核心靶点，结果如下表2。

表2 核心靶点结果表

注：Degree1为蛋白互作网络对应degree值；Degree2为靶点-通路网络对应degree值

GEO芯片核心靶点验证

GSE25724中共有13个样本，6个DM样本，7个正常样本，以矫正P值＜0.05为标准，筛选得到5949个差异基因。通过分析差异基因，以验证前面获得的核心靶点，其中HSP90AA1、EGFR具有显著性差异。结果如表3所示。

表3 GEO数据验证核心靶点表

分子对接验证

当结合能小于-5.0 kcal/mol表示有较好的结合活性。如表4所示，所有化合物与其对应的核心靶点结合能均小于-5.0 kcal/mol，所有化合物和其核心靶点均有良好的结合。

表4 化合物-核心靶点分子对接结果表

讨论

在中医理论中，糖尿病（消渴症）的核心病机为阴虚燥热与湿热内蕴。黄连自古便是治疗消渴的常用药，其酒炙品在现代研究中显示出优于生品的降糖调脂作用。这主要归因于炮制后显著升高的六种生物碱成分：药根碱、表小檗碱、小檗碱、黄连碱、巴马汀及非洲防己碱。它们通过多途径协同起效，如药根碱经Akt/AMPK/eNOS通路改善血管功能；小檗碱能上调PI3K/GLUT4表达并抑制PKC/TRPV1通路缓解神经痛；各成分在降低空腹血糖、改善糖耐量与调节血脂方面具有明确作用[4,5]。

通过网络药理学与GEO数据分析，本研究筛选出上述生物碱可能作用的七个核心靶点：AKT1、EGFR、MAPK14、NOS3、HSP90AA1、SRC和KDR。这些靶点广泛参与糖尿病及其并发症的关键过程：AKT1具有抗凋亡、保护胰岛细胞的功能；EGFR对糖尿病肾病有保护作用；MAPK14与炎症应激相关；NOS3基因影响T2DM易感性；HSP90AA1和SRC分别介导炎症反应与血管异常收缩；KDR则调控血管生成与纤维化[6-9]。

KEGG通路富集分析进一步表明，这些靶点显著富集于PI3K-Akt信号通路和胰岛素抵抗通路。PI3K/Akt信号减弱会导致肝糖输出增加和脂质异位沉积，从而引发并加剧胰岛素抵抗，形成促进T2DM发展的恶性循环[10]。酒炙黄连生物碱可能通过协同调控上述核心靶点，增强PI3K/Akt信号、抑制炎症与细胞凋亡，从而打断这一病理循环。

综上所述，本预测性研究提示，酒蒸黄连的特征生物碱可能通过多靶点、多通路机制发挥抗糖尿病作用。然而，其具体分子机制与药效关系仍需后续的体外与体内实验进一步验证和阐明。

参考文献

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作者简介：蔡家瀚，广州松田职业学院中药学专任教师，广州松田职业学院，511370，1999年5月出生，男，汉族，广东潮州，硕士研究生，初级中药师，主要从事中药学专业研究。