基于生物信息学筛选与多囊卵巢综合征相关的昼夜节律基因

摘要：目的 本研究旨在筛选昼夜节律相关多囊卵巢综合征（PCOS）致病基因（CR-PCOSGs）并探究其核心调控机制。方法 本研究利用R语言limma包从 GSE34526数据集筛选PCOS差异表达基因（DEGs），并与Genecard数据库中昼夜节律相关基因取交集，获得CR-PCOSGs；对CR-PCOSGs进行GO和KEGG富集分析；构建CR-PCOSGs的PPI互作网络，利用CytoHubba插件的MCC算法筛选核心Hub基因；最后利用GSE34526数据集验证核心Hub基因在PCOS组与健康对照组的表达水平。结果 从GSE34526数据集筛选得到332个PCOS DEGs，与2393个昼夜节律相关基因交集后获得33个CR-PCOSGs；GO富集分析显示，CR-PCOSGs在生物学过程中主要参与负调控免疫应答、白细胞迁移与增殖，细胞组分中富集于囊泡腔与膜微结构域，分子功能中集中在激酶活性与结合功能；KEGG富集分析显示，CR-PCOSGs主要富集于趋化因子信号通路、NOD 样受体信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等免疫炎症相关通路；PPI网络分析结合MCC算法筛选出IL10和CTSD，二者分别关联免疫炎症、蛋白酶水解功能模块；表达验证结果显示，IL10在PCOS组的表达水平显著低于健康对照组，CTSD在PCOS组的表达水平显著高于健康对照组。结论 本研究明确了IL10和CTSD可作为CR-PCOSGs的核心Hub基因，二者的表达特征及功能关联为揭示昼夜节律紊乱参与PCOS发病的分子机制提供了关键实验支撑，同时也为后续深入探究 PCOS的节律调控病理机制、挖掘疾病潜在调控靶点。

关键词 昼夜节律；PCOS；IL10；CTSD；生物信息学

PCOS是常见的影响哺乳动物生殖内分泌的疾病之一，也是造成生殖力下降或不育的主要原因，据估计，约1/5的育龄妇女受其影响[1-2]。PCOS是遗传因素和环境因素相互作用的结果，但其确切病因目前仍不清楚。

昼夜节律是生物在进化过程中形成的、以约24h为周期的内在生理节律，受核心时钟基因调控，使机体的代谢、内分泌、免疫、睡眠等生命活动与外界昼夜交替同步，维持内环境稳定[3]。越来越多的研究表明，熬夜、作息不规律、倒班、光照异常等造成的昼夜节律紊乱是PCOS发生发展的重要危险因素[4]。下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO 轴）是调控女性月经、排卵与内分泌稳态的核心神经内分泌轴[5]。正常生理状态下，下丘脑分泌GnRH，以规律的脉冲形式作用于垂体，促使垂体分泌FSH和LH，进而调控卵巢的卵泡发育、雌激素与孕激素分泌及排卵过程，形成周期性反馈调节。昼夜节律紊乱可破坏脉冲分泌、加重胰岛素抵抗、升高雄激素水平、增强慢性低度炎症和抑制抗炎因子IL-10，从神经内分泌、代谢、免疫等多个层面促进PCOS的病理进程。反之，PCOS患者体内高雄激素、慢性炎症与代谢紊乱又会进一步干扰时钟基因表达，形成恶性循环。因此，生物钟紊乱是PCOS的重要机制之一，恢复节律是潜在治疗策略。

1 方法

1.1 基因差异表达分析

利用R语言的limma包在GSE34526数据集中进行DEGs分析，以|log2FC| > 2且adj.P.Val< 0.05作为阈值。

1.2筛选CR-PCOSGs

DEGs与昼夜节律基因取交集获得CR-PCOSGs，并通过韦恩图进行展示。

1.3 功能富集分析

将CR-PCOSGs用于基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以解析其潜在功能。GO富集分析是大规模基因功能富集研究的常用方法，通常涵盖三个维度和三个层级：生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）。KEGG是一个广泛使用的数据库，存储基因组、生物通路、疾病和药物等信息。利用R语言包clusterProfiler进行GO功能注释，以识别显著富集的生物过程，并对富集结果进行可视化呈现，富集分析的显著性阈值设定为P<0.05。

1.4 构建PPI蛋白互作网络

将昼夜节律相关DEGs输入STRING数据库（https://string-db.org，11.5版本），物种限定为智人，互作评分设为>0.7，下载互作网络文件。并将文件导入 Cytoscape 软件（3.9.1版本），用于网络的可视化及Hub基因筛选。

1.5筛选Hub基因

将STRING数据库下载互作网络文件导入 Cytoscape 软件（3.9.1 版本），用于网络的可视化及Hub基因筛选。使用Cytoscape软件计算每个节点的网络属性，并通过CytoHubba插件中的MCC算法筛选出Hub基因。

1.6 Hub基因表达

针对每个Hub基因，使用ggplot2包绘制箱线图，展示基因在PCOS组与健康对照组的表达水平。

1.7统计分析

所有数据计算与统计分析均使用R语言（4.1.2版本）完成。

2结果

2.1 CR-PCOSGs筛选

基于R语言limma包对PCOS差异表达基因（DEGs）进行筛选，设定筛选阈值为 | logFC|＞2.0且校正后P值（adj.P.Val）＜0.05，即logFC＞2.0且 adj.P.Val＜0.05，或logFC＜-2.0 且 adj.P.Val＜0.05 的基因定义为PCOS相关 DEGs。通过上述标准从 GSE34526 数据集中共筛选得到 332 个PCOS 的DEGs（图1A）；同时从Genecard数据库检索并下载2393个昼夜节律相关基因集，将两者进行交集分析，最终获得33个CR-PCOSGs（图1B）。

2.2富集分析

GO富集分析从生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）三个层面，展示了 CR-PCOSGs的功能富集特征。BP结果显示CR-PCOSGs 主要参与负调控免疫应答、白细胞迁移与增殖；CC结果显示CR-PCOSGs高度集中在囊泡腔与膜微结构域；MF结果显示CR-PCOSGs富集条目集中在激酶活性与结合功能，如图1C所示。KEGG富集分析显示，CR-PCOSGs主要富集于趋化因子信号通路、NOD 样受体信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用等免疫炎症相关通路，如图1D所示。

图1 CR-PCOSGs筛选和富集分析（A）PCOS的DEGs（B）韦恩图（C）CR-PCOSGsGO富集分析气泡图（D）CR-PCOSGsKEGG富集分析气泡图

2.3 PPI互作网路

构建CR-PCOSGs PPI互作网络共得到 42 个节点与多条互作关系。网络分析发现，IL10、CTSD、HMOX1 为关键节点，分别连接免疫炎症、蛋白酶水解与氧化应激模块（图2A）。

2.4筛选CR-PCOSGs的Hub基因

利用CytoHubba插件的MCC算法对CR-PCOSGs的PPI网络进行核心节点筛选，最终得到IL10和CTSD为最高核心度的Hub基因，并形成两个关键功能模块，分别是免疫炎症模块和蛋白酶功能模块（图2B）。

2.5 Hub基因表达

利用GSE34526数据集中检测IL10和CTSD基因表达水平。结果显示，在 PCOS组与健康对照组的表达水平存在显著差异。IL10基因在健康对照组的表达水平显著高于PCOS组；CTSD基因在PCOS组的表达水平显著高于健康对照组，验证了IL10和CTSD作为CR-PCOSGs Hub基因的表达特征差异，如图2C、D所示。

图2 CR-PCOSGs的核心Hub基因筛选和验证（A）33个CR-PCOSGs PPI互作网络图（B）CR-PCOSG核心Hub基因的子网络图（C）IL10 mRNA表达水平（D）CTSD mRNA表达水平

3 讨论

本研究利用生物信息学研究方法筛选出CR-PCOSGs的核心Hub基因IL10与CTSD，可为阐释昼夜节律紊乱参与 PCOS 发病机制提供重要依据。CTSD（组织蛋白酶D）位于人类11号染色体，编码溶酶体天冬氨酸蛋白酶，参与蛋白水解、细胞凋亡、抗原提呈、组织重塑等关键生物学过程。有研究表明，CTSD可以通过促进肿瘤细胞侵袭、裂解细胞外基质蛋白等过成参与乳腺癌、阿尔茨海默病、神经元蜡样脂褐质沉积症等疾病进展[6]。Ye等研究表明，CTSD 可通过调控线粒体自噬进程、介导卵巢局部免疫浸润，诱导颗粒细胞凋亡，进而参与PCOS的发生发展[7]。本研究结果与上述结果一致，CTSD 在 PCOS 患者中呈显著上调表达，据此推测 PCOS 中溶酶体蛋白酶系统的异常激活，或与昼夜节律紊乱存在密切的调控关联。IL10作为关键抗炎因子，有研究表明人骨髓间充质干细胞来源的IL-10可逆转PCOS引发的炎症[8]。一项meta分析发现，活动性溃疡性结肠炎患者体内的生物钟基因 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1与IL10的表达趋势一致，提示生物钟基因和炎症基因可能共同参与了活动性溃疡性结肠炎的发病过程[9]。另有研究证实，肠道生物钟功能紊乱会引发宿主免疫失衡，进而促进类炎症性肠病结肠炎的发生与进展，增强肠道生物钟功能，可调控炎症性肠病的发病进程[10]。现有多项研究证实，PCOS 患者卵泡液中存在明显的促炎微环境，表现为炎性因子水平升高，而抗炎因子IL-10表达水平降低[11]。本研究结果显示，IL10在 PCOS 组中表达显著下调，可以作为CR-PCOSGs的核心Hub基因。以上结果均提示昼夜节律紊乱可导致IL10 表达异常，异常水平的IL10是导致炎症失衡、参与 PCOS 发病的关键分子。

  本研究利用生物信息学研究方法筛选出2个CR-PCOSGs的核心Hub基因（CTSD、IL10），二者在PCOS患者中呈现截然相反的表达特征，且其表达异常均与昼夜节律紊乱密切关联。CTSD和IL10有望为 PCOS的个体化治疗提供指导、助力新治疗策略的开发，并为挖掘疾病新靶点奠定基础。

参考文献

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基金项目：儋州市科学技术和工业信息化局科研项目

项目编号：儋科工信[2024]82号