幽门螺杆菌对慢阻肺大鼠肺功能损伤及肠道菌群失衡的作用研究

【摘要】目的 研究幽门螺杆菌（Hp）对慢阻肺（COPD）大鼠肺功能损伤及肠道菌群失衡的作用。方法 将34只SPF级wistar大鼠随机分为实验1组（COPD模型，8只）、实验2组（COPD+Hp双重模型，9只）、实验3组（Hp，9只）、空白对照组（8只）。造模成功后，从各组随机抽取4只大鼠，用小动物肺功能测定仪测定肺功能，并收集上述大鼠新鲜粪便，利用16SrDNA测序检测各模型大鼠粪便肠道菌群，剩下大鼠给予鼠李糖乳杆菌活菌菌粉（5mg/kg）灌胃治疗（2ml/100g），1月后测定各组大鼠肺功能指标。对比灌胃前后的肺功能指标，并观察建模后各组的肠道菌群Shannon 指数以及门水平菌群相对丰度的情况。结果 灌胃前与灌胃后，4组大鼠的肺功能指标Vt、R、CL、PEF差异均有统计学意义（P＜0.05）；灌胃前实验3组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），实验2组的Vt、CL、PEF最低，Re最高（P＜0.05）；灌胃后实验1组的Vt、CL、PEF最低，Re最高（P＜0.05），实验2组、实验3组及对照组对比各项肺功能指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。4组大鼠的肠道菌群情况中Shannon 指数、门水平相对丰度差异均有统计学意义（P＜0.05），实验1组与对照组对比差异无统计学意义（P＞0.05），实验2组的Shannon 指数、厚壁菌门相对丰度最低，拟杆菌门、变形菌门相对丰度最高，且与另3组对比差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 Hp感染不仅会造成COPD大鼠的肠道菌群失衡，还会进一步加重其肺功能损伤程度，益生菌治疗有助于Hp感染+COPD大鼠的肺功能改善。

【关键词】 幽门螺杆菌；慢阻肺；肺功能；肠道菌群

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是临床上较为常见的一种呼吸系统疾病，据估计，我国COPD患病率在未来仍呈上升趋势，给家庭与社会带来严重的负担[1-2]。因此，明确COPD的发病机制以及优化治疗方案显得尤为重要[3-4]。为进一步证实该推测，并明确益生菌治疗对COPD肺功能的影响，本研究将通过大鼠实验分析Hp对COPD大鼠肺功能损伤及肠道菌群失衡的作用，以及益生菌治疗对Hp感染+COPD大鼠的肺功能影响，为优化COPD的个体化诊治方案提供依据。

1 材料与方法

1.1实验大鼠

34只SPF级wistar大鼠，8~10周，重量（230±20）g，适应性喂养一周后开始进行实验。

1.2分组与模型建立

（1）分组：将34只大鼠随机分为4组，分别是：实验1组（COPD模型，8只）、实验2组（COPD+Hp双重模型，9只）、实验3组（Hp，9只）、空白对照组（8只）。

（2）COPD模型建立：将实验1组、2组大鼠分别于第1、14天将大鼠用3.5%的水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，暴露声门，以拔除针芯的16号静脉套管针快速插入气管，注入溶于注射用生理盐水的LPS（美国Sigma公司，O55:B5 1mg/ml），将大鼠固定板直立旋转，拔出套管针。第2～40天（第14天除外）将小鼠置于有机玻璃熏箱内被动吸烟，10支香烟/次，1h/次，两次熏烟间隔4h。采用小动物肺功能测定仪检测确认模型建立成功。

（3）Hp感染模型建立：购买国际统一的SS1幽门螺杆菌菌株，经鉴定Cag A(+)和Vac A(+)，接种于改良Skirrow培养基上，置厌氧培养箱中，37℃，培养72h，经G染色及尿素酶、触酶试验鉴定后，将典型菌落传代，同样条件下培养72h，灭菌生理盐水冲洗，酶标仪测定OD550值在4.8-8.4之间。实验2组、3组大鼠禁食水12h，经胃灌入0.5ml(0.1mol/L)Na2CO3，1h后灌胃标准菌株0.5ml，禁食禁水4h，隔天灌胃1次，共5次。其余大鼠灌入相同剂量0.9%氯化钠溶液。随机抽取实验2组、3组大鼠各一只，取胃窦黏膜组织进行快速尿素酶试验，明确Hp感染。

1.3大鼠肺功能检测

从4组大鼠中随机各抽取4只大鼠，经腹腔麻醉后，纵行切开颈部，充分暴露气管，环状软骨处做“T”型切口，气管插管后连接小动物肺功能测定仪进行检测。

1.4大鼠粪便肠道菌群检测

肺功能检测完毕后，处死大鼠，收集结肠内新鲜大便。粪便细菌总DNA提取及质量检测，16SrRNA基因V3-V4区PCR扩增，16SrRNA Miseq高通量测序。

1.5鼠李糖乳杆菌活菌菌粉灌胃治疗与肺功能检测

购买鼠李糖乳杆菌活菌菌粉（5mg/kg），用蒸馏水溶解备用，实验组给予鼠李糖乳杆菌活菌灌胃，灌胃量为 2ml/100g，对照组给予同等量生理盐水灌胃，记录大鼠每周体重，调整灌胃量。共灌胃30天。用小动物肺功能测定仪测定剩余大鼠肺功能，记录数据。

1.6观察指标

（1）对比3个实验组（各4只）与对照组（4只）大鼠建模后的肺功能指标、肠道菌群情况。肺功能指标包括潮气量（Vt）、 呼气阻力（Re）、肺顺应性（CL）、呼气峰流速（PEF），肠道菌群指标包括α多样性（Shannon 指数）、门水平菌群相对丰度。

（2）对比3个实验组与对照组剩余大鼠在鼠李糖乳杆菌活菌灌胃或生理盐水灌胃后的肺功能指标。

1.8统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，正态分布计量资料用（`x±s）表示，两组间对比采用独立样本t检验，多组间对比采用单因素方差分析；非正态分布计量资料用M（Q1，Q3）表示，采用非参数检验。计数资料用[n(%)]表示，采用x2检验。当P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1实验组与对照组大鼠建模后的肺功能指标对比分析

灌胃前与灌胃后，4组大鼠的肺功能指标Vt、R、CL、PEF差异均有统计学意义（P＜0.05），其中实验3组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），灌胃前实验2组的Vt、CL、PEF最低，Re最高（P＜0.05）；灌胃后实验1组的Vt、CL、PEF最低，Re最高（P＜0.05），实验2组、实验3组及对照组对比各项肺功能指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1实验组与对照组大鼠建模后的肺功能指标对比分析

注：a表示与实验1组对比，P＜0.05；b表示与实验2组对比，P＜0.05；c表示与实验3组对比，P＜0.05。

2.2实验组与对照组大鼠建模后的肠道菌群情况对比分析

4组大鼠的肠道菌群情况中Shannon 指数、门水平相对丰度差异均有统计学意义（P＜0.05），实验1组与对照组对比差异无统计学意义（P＞0.05）；实验2组的Shannon 指数、厚壁菌门相对丰度最低，拟杆菌门、变形菌门相对丰度最高（P＜0.05）。见表2。

表2 实验组与对照组大鼠建模后的肠道菌群情况对比分析（`x±s）

注：a表示与实验1组对比，P＜0.05；b表示与实验2组对比，P＜0.05；c表示与实验3组对比，P＜0.05。

3 讨论

肺与大肠在胚胎学同源性、黏膜免疫系统等方面具有共同的生物学基础，使COPD病情的进展不仅与肺部菌群有关，还可能与肠道菌群有关，尤其是合并Hp感染，可能通过肺-肠轴加剧COPD病情进展[4]。这为COPD的个体化治疗提供了新的线索，益生菌在这部分特殊COPD患者的治疗中具有潜在价值，通过大鼠的实验研究可以间接反映患者的情况，从而为临床研究提供科学依据。

本研究结果显示，灌胃前实验3组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），实验2组的Vt、CL、PEF最低，Re最高（P＜0.05）。提示Hp感染加剧了COPD的病情，导致这部分大鼠的肺功能受损程度加重。4组大鼠的肠道菌群情况中Shannon 指数、门水平相对丰度差异均有统计学意义（P＜0.05），实验1组与对照组对比差异无统计学意义（P＞0.05），实验2组的Shannon 指数、厚壁菌门相对丰度最低，拟杆菌门、变形菌门相对丰度最高（P＜0.05）。由此可知，Hp感染本身会引起肠道菌群失衡，当Hp感染合并COPD时会加剧肠道失衡。Hp感染会影响胃肠道微环境状态，比如酸度降低、黏膜炎症加剧，导致原有的肠道菌群结构被打破，为致病菌的增殖提供了条件，进而加重肠道屏障损伤、炎症反应，通过肠-肺轴放大肺部炎症，导致肺功能损伤加剧[5-6]。

综上所述，Hp感染不仅会造成COPD大鼠的肠道菌群失衡，还会进一步加重其肺功能损伤程度，益生菌治疗有助于Hp感染+COPD大鼠的肺功能改善。

参考文献

[1] 陈学琴,王仕鸿,赖凤霞,等. 1990-2021年中国慢性阻塞性肺疾病发病、患病和死亡趋势分析及未来10年预测研究[J].中国全科医学,2026,29(2):264-272.

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张婕,魏文峰,宋丹,等.基于"肺-肠轴"探讨肠道菌群对肺部疾病的影响[J].国际呼吸杂志,2022,42(10):795-800.

项目名称：幽门螺旋杆菌感染的慢阻肺大鼠肺功能及肠

道益生菌菌群变化

项目编号：BYJJ-DXK 2022026