共培养模式下高活性菌株的培育与筛选

[摘要]  目的：解决蛇足石杉内生菌长时间脱离宿主植物后易丢失目标产物的合成能力，获得持续高产菌株。方法：根据微生物共培养模式，为可产石杉碱甲内生菌提供更为多元化的微生物酶系统，通过HPLC法对共培养产物测定，分析目标菌种代谢能力的变化，筛选出传代后依旧高产石杉碱甲的菌株。结果：本实验室筛选的内生真菌与细菌在共培养时，18h时目标检测HupA达到最大值。通过共培养的多酶促系统，可以进一步提高Hup A产量。结论：解决内生菌在脱离宿主一段时间后易丢失或代谢能力变弱等关键的瓶颈技术问题，为工业化生产获得高质量的石杉碱甲获得解决路径。

[关键词]：石杉碱甲，内生真菌，内生细菌，共培养

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD），是以认知性功能障碍为特征的神经退行性疾病[1]。目前AD发病机制尚未明确，多数学者认为Aβ毒性学说、Tau蛋白修饰异常、胆碱能损伤、神经炎症是AD发病的主要原因[2]。胆碱酯酶抑制剂（ChEls）是当前主要治疗AD的药物，能增加突触间隙乙酰胆碱含量，延缓AD的认知功能衰退，其主要包括多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏和石杉碱甲[3]。但是多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏延缓患者认知衰退的临床效果不明显，部分患者还出现严重的腹泻、呕吐和眩晕等不良反应[4]，且这三种药物价格高昂，考虑到患者经济条件，易促使患者中断用药甚至怠慢治疗。

石杉碱甲（Huperzine A, Hup A）是一种从中草药蛇足石杉中分离提取的生物碱，可通过强效抑制脑内AChE，激活胆碱能递质系统，促进患者记忆和认知功能提高[5-6]。与多奈哌齐等胆碱酯酶抑制剂药物相比，Hup A是天然植物提取物，安全性高、不良反应较少、人体能快速吸收，抑制方式为竞争性和非竞争性的混合型抑制，治疗效果理想，有效时间长[7]。蛇足石杉虽然在世界各地均有分布，但其资源十分受限。从蛇足石杉中提取Hup A的含量甚微，而化学合成Hup A工艺繁琐，成本高，有副产物干扰，在临床应用中具有潜在毒性难以工业化生产，不易推广。研究一种低成本，能提高Hup A含量的新方法尤其重要。

内生真菌是一类生活在植物茎和叶组织内的真菌，基于内生真菌与植株长时间共生进化，它们就可以通过基因重组获得宿主植物的某些基因，产生与宿主植物相同的次生代谢物的理论[8-10]，根据微生物共培养模式，为可产Hup A的内生菌提供更加多样的微生物酶系统，本研究拟通过多菌株的共培养再次激活微生物生物合成的关键酶系统，从而解决内生菌长时间脱离宿主植物后易丢失目标产物的合成能力，获得持续高产的菌株，探索一种新型、高效、绿色的合成方法，从而为Hup A生物合成的产业化应用奠定理论基础。

1   材料与方法

试剂与仪器

    使用的菌种为本实验室筛选出的蛇足石杉内生的细菌和真菌，Hup A标准品。恒温培养箱(BSP-400)，上海博迅有限公司；恒温摇床(ZHNY-2112B)，天津欧诺有限公司；高速冷冻离心机(5424R)，德国Eppendorf公司；旋转蒸发仪(RE-2000)，上海亚荣生化仪器厂，显微镜(E100)，中国尼康公司；高效液相色谱仪(Agilent1100型)，美国安捷伦公司。试剂：5%、0.5%的盐酸（HCl）、浓氨水(NH3·H2O) 、乙醚、氯仿。。

 培养基的制备

PDA固体培养基（本实验室改良后）：马铃薯300 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，无机盐混合物成分5mg，蒸馏水1000 ml。

PDA液体培养基（本实验室改良后）：马铃薯300 g，葡萄糖20 g，无机盐混合物成分5mg，蒸馏水1000 ml。

蛇足石杉内生真菌与细菌的传代培养与接种

将分离获得的蛇足石杉内生细菌和真菌分别接入PDA固体培养基，置于恒温培养箱中培养，细菌35℃培养48小时；真菌26℃培养72小时。将固体培养基中传代培养得到的菌株分别接种于装有200ml PDA培养基的500ml锥形瓶。细菌置于摇床中35℃，120r/min，震荡培养48h；真菌置于摇床中26℃，120r / min培养72h。将培养好的真菌与细菌混合接种于装有200ml PDA培养基的500ml锥形瓶制成混合菌液（每种混合菌接3瓶），置于摇床上26℃，120r / min培养6h，12h，24h。

 Hup A萃取

取上述培养菌株液体培养基，第一组于破碎机中破碎15分钟，第二组不破碎，配置5%的稀盐酸和0.5%的稀盐酸将两组液体培养基的菌液均酸化至pH=3.0，放置2小时后，于离心机中5000 r /min离心15分钟，取上清液，再用浓氨水将上清液均碱化至pH=9.0。本实验采用氯仿和乙醚进行提取，依靠溶解度差异性使目标物质在两相中选择性分配达到分离目的。

 高效液相色谱法测定发酵液Hup A含量

通过高效液相色谱法对驯化的菌株代谢产物质量进行分析，考察产物质量。通过构建标准曲线，根据样品中目标成分的峰面积，计算出其浓度，以数据评估反应效率和优化工艺。

1.5.1 样品准备

溶解：取发酵液离心后的上清液50 mL，采用二氯甲烷和乙醚提取方法提取 HupA，用甲醇定容到 5 mL，置于冰箱备用。

过滤：使用有机相的微孔滤膜过滤样品，以去除可能堵塞色谱柱的颗粒物。

1.5.2  HPLC分析

色谱条件设置：高效液相（HPLC）色谱柱为 Agilent Cl8 柱（4.60 mm×250 mm，5 µm）；色谱条件：流动相为甲醇-0.1%甲酸（75：25）；流量 1.0 mL/min；柱温 25 ℃，进样量 20 µL；检测波长 310 nm。

标准曲线制备：以 HupA 标准品作对照，配制已知浓度的标准品溶液，通过HPLC分析，绘制峰面积与浓度的标准曲线,对产物质量进行分析。

样品分析：将处理好的样品注入HPLC系统，进行色谱分离，记录产物的峰面积，并通过检测和数据处理得到浓度测定结果。

1.5.3产量计算

    峰面积对比：将样品的峰面积与标准曲线对比，计算出样品中产物的浓度。

产量计算：根据样品的浓度和体积，计算出总产量。

2  结果与分析

2.1标准曲线的绘制

以相对应时间的峰面积为纵坐标， HupA标品的浓度( mg /L) 为横坐标进行回归用 HPLC仪测定并绘制标准曲线，求得回归方程：y=27594.0173x-13.2374，有数据可知， HupA的含量在0.125-0.0125mg范围内有较好的线性关系。

2.2稳定性试验

由实验数据计算得出： HupA标品稳定性实验结果RSD=1.66%，说明 HPLC法测定 HupA的方法稳定性良好。

2.3精密度试验

由实验数据计算得出：精密度实验结果RSD=0.24%，表明 HPLC法测定 HupA含量精密度良好。

2.4重复性试验

由实验数据计算得出： HupA重复性实验结果RSD=1.86%，表明 HPLC法测定 HupA含量重复性良好。

2.5代谢产物HPLC测定数据

HPLC分析，HupA 标准品在 6.584min 出有较强吸收峰，峰面积为223.72386，分析样品在该相近时间出峰面积，按照线性回归方程y = 27594x - 13.237，r= 0.9996得到浓度如上图，按照时间轴可推算，本实验室筛选的内生真菌与细菌在共培养时，培养至18h时目标检测HupA达到最大值。

图1 内生真菌与内生细菌共培养 HPLC数据

3  讨论与展望

由于天然蛇足石杉资源稀缺、生长周期长等不利于大量提取的原因，采取适宜的培养条件提高产量是需要进一步进行探索讨论的。

在实验过程中我们发现微生物在培养基中的共培养条件显著影响产物Hup A的产量，目前通过实验研究微生物的共培养方式，为菌种提供更加多样的微生物酶系统等方式，能有效提高Hup A的产量，但对于满足其临床需求，进入工业化生产还需要进一步探索有利的反应条件。

参考文献：

[1] 贾建平, 周爱红. 阿尔茨海默病诊疗指南解读[J]. 中华神经科杂志, 2020, 53(12):968-974.

[2] 张颖, 李廷利. 阿尔茨海默病发病机制研究进展[J]. 神经解剖学杂志, 2021, 37(2):229-234.

[3] 陈丽萍, 刘学伍. 胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔茨海默病的研究进展[J]. 中国新药与临床杂志, 2019, 38(6):321-325.

[4] 张明园, 何燕玲. 抗痴呆药物的疗效与安全性评价[J]. 中华精神科杂志, 2018, 51(4):221-225.

[5] 朱东亚, 刘乃泉. 石杉碱甲的药理作用与临床应用研究进展[J]. 中草药, 2020, 51(12):3245-3254.

[6] 唐希灿. 石杉碱甲的研究与开发[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(1):1-7.

[7] 周玉萍, 王春华. 石杉碱甲与多奈哌齐治疗轻中度阿尔茨海默病的对比研究[J]. 中国现代应用药学, 2019, 36(10):1266-1269.

[8] 邱德文, 阮期平. 植物内生真菌次生代谢产物多样性及其应用前景[J]. 微生物学报, 2021, 61(3):567-582.

[9] 邹文欣, 谭仁祥. 植物内生真菌研究新进展[J]. 菌物学报, 2019, 38(2):167-184.

[10] 李寅, 张延平. 微生物共培养激活沉默基因簇合成次生代谢产物[J]. 生物工程学报, 2022, 38(1):1-12.

项目编号202311840011）陕西省大学生创新创业项目（项目编号S202311840048），陕西省教育厅服务地方专项（项目编号24JC080）国家级大学生创新创业训练项目