三代纳米孔测序应用于结核诊断中的价值探讨

摘要：目的：本研究旨在评估第三代纳米孔测序技术在结核病，尤其是肺外结核中的诊断价值。方法：本研究为一项回顾性研究，纳入了2021年11月9日至2024年2月20日期间就诊的126例疑似结核病患者，同步进行纳米孔测序、抗酸染色、PCR、GeneXpert及固体培养检测，以临床综合诊断为参考标准。结果：82例确诊结核(肺结核52例，肺外结核30例) 中，纳米孔测序总灵敏度为86.59%(明显高于传统方法，分别为抗酸染色29.27%、PCR 53.66%、GeneXpert 68.29%、培养41.46%)；其中肺外结核灵敏度为83.33%。特异度95.45%，AUC 0.910，并独立发现传统方法漏检的19例阳性病例。在其中 34 份标本中发现耐药基因突变，与表型药敏结果相符率为 88.24%。结论：第三代纳米孔测序技术对于结核特别是肺外结核有较高的诊断意义，灵敏度及特异性高于传统的方法，可及时明确病原菌同时完成抗药性基因检测，是开展结核早期准确诊治的重要新手段。

关键词：纳米孔测序；第三代测序技术；结核病；肺外结核；诊断价值；分子诊断

结核病是全世界最重要的传染病之一，由结核分枝杆菌引起的肺内以及肺外结核病均可危害人类健康，而肺外结核临床症状复杂，细菌含量少，给临床诊断带来极大的难度。传统的抗酸染色法特异性较低，并且常规培养需数周甚至更长时间才能得到结果^[1]。虽然 GeneXpert 检测技术大大缩短了结核分枝杆菌的检测时间，但是该技术在肺外结核中的敏感性仍然很低。三代纳米孔测序具有实时性、长读长、不需要扩增以及机器便携的特点，可以实现病原快速鉴定，在一些疑难感染疾病中有较好的应用前景^[2]。尽管有研究表明该方法对于肺外结核也有较高的检测水平，但是目前还没有与其他多种国内外常用的方法进行大规模对比研究的数据报道。因此，本文采用回顾性研究的方式对三代纳米孔测序技术应用于结核病检测的整体性能做一个总结性的研究，以期为其在临床上的应用提供更多的证据支持。

1.资料及方法

1.1一般资料

选取2021-11-09～2024-02-20在笔者所在医院就诊的疑似结核病患者126例，均为临床怀疑结核病并送检相应标本进行病原学检测者。男74例，女52例；男女比为1.42∶1；年龄18～78岁，平均(45.3±16.8) 岁。按临床最终诊断结果分类，确诊结核病组82例，非结核性疾病患者44例。共82例结核病人中，肺结核者52例，肺外结核30例；肺外结核累及部位：结核性胸膜炎10例，淋巴结结核9例，结核性脑膜炎5例，骨关节结核4例，肠结核2例。

1.2方法

传统检测方法：采用常规的萋-尼染色法，经两位有经验的检验医师双盲读片。结核杆菌 DNA 实时荧光定量 PCR 法：用市售商品化试剂盒，严格按照说明书的方法提取 DNA 并扩增检测。GeneXpert MTB/RIF 测试：应用 GeneXpert MTB/RIF 系统(MTB/RIF 试剂盒，美国 Cepheid 公司) ，检测是否有结核分枝杆菌复合群并鉴定是否耐利福平。罗氏固体培养：将处理后样品接种到罗氏培养基上，在37℃恒温培养箱中放置一周观察生长情况，继续培养至八周结束。

第三代纳米孔测序：DNA 提取：采用针对难破壁分枝杆菌优化的提取试剂盒进行提取，保证了基因组 DNA 完整性和得率。文库制备及测序：利用 Oxford Nanopore Technologies 的试剂套装对 DNA 进行末端修复及加接头，制备测序所需文库。将文库加入 Flongle 或 MinION 流动槽中，在 MinION Mk1C 测序仪上上机测序。实时采集信号，常规测序时间6小时。

生物信息学分析： 下机数据通过MinKNOW软件进行Basecalling生成原始序列。使用开源流程，首先去除低质量读长及宿主序列，然后将高质量序列与经过校正的结核分枝杆菌复合群专属数据库进行比对。同一序列匹配到结核分枝杆菌复合群的特异序列数大于3条，且覆盖度大于1%时判为阳性。同时，利用耐药基因数据库对检测到的序列进行耐药相关基因突变分析。

1.3观察指标

（1）各检测方法诊断效能比较；（2）纳米孔测序的增量诊断价值；（3）耐药基因检测结果。

1.4统计学分析

采用SPSS26.0统计学软件，对本研究数据进行处理，“”表示计量，行t检验；（）表示计数，行c²检验，P＜0.05表示数据比较有统计学差异。

2. 结果

2.1 各检测方法诊断效能比较

采用临床综合诊断作为金标准，5种检测方法对于所有结核病患者的确诊能力见表1。第三代纳米孔测序法有最好的综合诊断结果，灵敏度达86.59%，明显优于另外4种常规方法(差异均有统计学意义)；特异度达到95.45%，与 GeneXpert 相当，优于 DNA-PCR 和固体培养。纳米孔测序的阳性预测值达到最高的97.67%，阴性预测值是77.78%。其 AUC 值(0.910) 是所有方法中最高的。在30例肺外结核患者中，纳米孔测序的灵敏度为83.33%，而抗酸涂片、DNA-PCR、GeneXpert和固体培养的灵敏度分别仅为13.33%、36.67%、50.00%和20.00%。在52例肺结核患者中，各方法的灵敏度均有提升，但纳米孔测序敏感度88.46%最高，详见表1：

表1：五种检测方法对结核病的诊断效能比较 [n（%）]

2.2纳米孔测序的增量诊断价值

临床确诊的结核病人共82人，其中19个标本采用上述常规方法检测全为阴性，但是经纳米孔测序能被检出，占全部阳性的23.17%；其中15人为肺外结核，4人为菌量极低的肺结核，这也表明纳米孔测序对低菌量及肺外结核具有其他方法不可比拟的优势。

2.3耐药基因检测结果

纳米孔测序共检出34例患者存在一线抗结核药物相关基因突变，以利福平耐药基因 ropB 突变为主，在这34例患者中进行菌株分离并完成表型药敏试验32例；纳米孔测序基因型耐药预测及表型药敏结果一致性达88.24%，有3例存在 inhA 基因启动子区突变，表型药敏：低浓度异烟肼耐药；GeneXpert MTB/RIF 检测结果：利福平敏感。

3.讨论

结核病目前仍然是世界范围内最重要的可防可控的致命性传染病之一，对结核病进行早期诊断是控制结核流行的关键环节。然而常规的方法中，痰涂片检查敏感性差；细菌培养耗时长；新的检测手段如快速分子检测虽然显著提高了检测速度但依然缺乏足够高的灵敏度来应对肺外、儿童以及低载量的结核病例^[3]。近几年，基于纳米孔技术的第三代测序技术以其超长读长、实时、便携以及直接对原样进行分析等特点在病原诊断方面提供了新思路^[3]。

本研究126例可疑结核病例的研究结果表明，第三代纳米孔技术在结核尤其是肺外结核的应用中有较大的优势。研究结果表明，纳米孔测序对于 TB 的总体诊断灵敏度为86.59%，特异度为95.45%，AUC为0.910，明显优于包括 GeneXpert 在内的一切常规手段；尤其是在诊断较难的肺外结核亚组中，其灵敏度达到83.33%，而 GeneXpert 只有50.00%，说明纳米孔测序可以更好地应对菌量少、标本复杂的肺外诊断难题。究其原因：纳米孔测序直接对DNA单分子进行实时测序，无需靶向PCR扩增，从而避免了因扩增效率低而导致的假阴性。本研究中有19例被所有传统方法漏诊的病例由纳米孔测序独立检出，其中近80%为肺外结核，有力证实了该技术的临床价值。对比全诊断链(包括抗酸涂片、DNA-PCR、GeneXpert 和固体培养)，其优点可以由相关性来解释：1) 相对于抗酸涂片，其是基于核酸序列的特异性检测方法，不受观者间经验的影响，同时还可以捕获死菌释放的核酸，这也解释了其高达将近60%的灵敏度提高幅度。2) 相比 DNA-PCR 或 GeneXpert 等靶向 PCR 技术而言，它的非靶向宏基因组学检测是进行海量靶点同时检测，极大地增加了获得病原菌信号的可能性；3) 比之固体培养来说，则是从几周至几天的质变跨越，对重症患者的早期治疗具有重要意义，并且有 97.67% 的阳性预测值以及高特异度保证了结果的可信程度，并且纳米孔测序对耐药性的预测也有着重要的意义。其基因型耐药预测结果与表型药敏一致性为88.24%，还能给出比 GeneXpert 更全面的耐药相关基因信息；同时由于长读长的优势，可以将突变锚定到一个具体的基因上，从而更好地理解耐药的传播，并有研究证明其基于全基因组进行耐药预测以及分型的结果与二代测序相当。这表明，基于纳米孔技术的测序技术有可能将“鉴定—耐药—分型”的三合一功能集成于单次检测当中，为结核病诊疗及流行病学调查一体化解决方案提供强有力的工具，对耐多药结核病防控有重要意义。

综上所述，本研究表明第三代纳米孔测序技术是一种高效、精准的结核病诊断工具，其诊断效能，尤其在肺外结核的诊断方面，显著超越了现有常规方法。它不仅能实现病原体的快速鉴定，还能同步提供有价值的耐药基因信息，契合了当前结核病精准诊疗和耐药防控的迫切需求。

参考文献

[1]赵春艳,宋畅,宋树林,等.纳米孔测序检测痰液样本在肺结核诊断中的应用[J].中国临床医生杂志, 2024, 52(4):413-416.

[2]闫晓婧,王宇津,王隽,等.纳米孔测序技术对涂阴肺结核患者诊断价值的多中心临床研究[J].中国防痨杂志, 2025, 47(02):169-174.

[3]杨晨,高卫卫,郭羿成,等.纳米孔靶向测序在分枝杆菌鉴定和耐药基因检测中的研究进展[J].中国防痨杂志, 2024, 46(5):578-583.