基于网络药理学探讨肾纤康抗肾纤维化的作用机制

【摘要】目的：使用网络药理学技术分析并预测中药复方肾纤康抗肾纤维化的作用机制。方法：从TCMSP、BATMAN-TCM数据库中筛选肾纤康所含中药的化学成分和作用靶点；在Genecards、OMIM、DrugBank数据库查询肾脏纤维化的相关靶点，将二者靶点取重后导入String数据库获得蛋白质相互作用网络，将其进行整合后进行GO及KEGG分析导入Cytoscape筛选出核心靶点，最后利用Metascape数据库进行GO及 KEGG富集分析。结果：肾纤康治疗肾纤维化的主要成分为槲皮素、水蛭素、藏红花素等，核心靶点为IL6、TNF、AKT1、BMP-7等，关键通路涉及TGF-β信号通路、HIF-1信号通路等。结论：肾纤康复方中的多种有效成分可通过多靶点、多信号通路抑制肾脏纤维化，为后续研究提供参考依据。

【关键词】肾纤维化、间充质转分化、肾纤康、网络药理学

Exploring the mechanism of action of renal fibrocon against renal fibrosis based on network pharmacology

【Abstract】Objective：Analysis and prediction of the anti-renal fibrosis mechanism of action of the traditional Chinese medicine compound Kidney Fibrokang using network pharmacology techniques. Methods：The TCMSP and BATMAN-TCM databases were used to screen the chemical constituents and targets of the traditional Chinese medicines contained in Kidney FibroKang; the Genecards, OMIM and DrugBank databases were queried for targets related to renal fibrosis.They were integrated and subjected to GO and KEGG analyses.Results: The main ingredients of Renal Fibrokang for the treatment of renal fibrosis include quercetin, hirudin, saffronin,etc,and the core targets are IL6, TNF, AKT1, BMP-7, etc., and the key pathways involve the TGF-β signalling pathway, HIF-1 signalling pathway and so on.

Key Words：Renal fibrosis; EMT; SXK; Network pharmacology

慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease, CKD)是一种严重威胁人类健康的重大疾病，发病率已达10.8%，且呈逐年上升趋势[1]，其中肾纤维化是进展至终末期肾病阶段的共同通路[2]，如何有效防治和延缓肾纤维化是肾脏病领域研究的重点。本课题组以中医“肾内微癥积”来定义肾脏纤维化，制定出了复方肾纤康，全方由黄芪、水蛭、当归、莪术、生大黄、白花蛇舌草、淫羊藿共7味中药组成，共奏“益气活血，固肾消癥”之功。课题组前期已发现肾纤康对防治CKD具有较好的临床疗效[3-4]，在动物实验上亦发现其显著优势[5-7]。但中药复方的组方及作用机制不能使用单一的药理学分析进行研究，网络药理学能够从新的角度阐释中医药理论的内涵，为中医药的现代化应用打开了大门[8]。因此，本研究将使用网络药理学对肾纤康进行分析，为后续的研究拓宽思路。

1 材料与方法

1.1肾纤康所含中药活性成分及其靶点的收集

在TCMSP数据库中以药物口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性（DL）≥0.18为条件进行检索，其中“水蛭”使用BATMAN-TCM数据库进行补充，最后将两个数据库筛选出的活性成分和靶点进行汇总。

1.2 构建“肾纤康-活性成分-靶点”网络

将肾纤康的活性成分及靶点导入Cytoscape软件，构建“肾纤康-活性成分-靶点”网络图，使用Cytoscape中“Network Analyzer”工具分析网络特征。

1.3肾脏纤维化相关基因靶点收集及筛选

    在Genecard、DrugBank、OMIM数据库中以“Renal fibrosis”为关键词进行检索，合并去重保留唯一项，最后得到肾纤维化的标准靶点。

1.4 PPI网络图的构建与核心靶点的筛选

   使用Venny平台取得肾纤康与肾纤维化靶点的交集靶点，导入String平台获得蛋白质互作关系图（PPI），去除无相互作用靶点后，导入 Cytoscape应用内置的CentiScape插件筛选核心靶点以及可视化处理。

1.5通路富集分析

  将筛选所得核心靶点导入Metascape 平台进行GO和KEGG 分析，并通过R软件进行可视化呈现。

2结果

2.1肾纤康活性成分及靶点获取

在TCMSP 数据库中检索到肾纤康的有效成分77个，黄芪20个、淫羊藿23个、莪术3个、生大黄16个、白花蛇舌草7个、当归2个、水蛭6个，将有效成分所含靶点合并后排除重复值，共获得462个有效靶点。

2.2肾纤康“活性成分-靶点”网络构建和分析

使用 Cytoscape构建“药物-成分-靶点”网络图，见图1，根据度值筛选出该网络中排名前5位的药物活性成分，这些可能是肾纤康发挥作用的主要成分，,基本信息见表1。

图1“肾纤康-活性成-靶点”网络图

表1关键活性成分基本信息

2.3肾脏纤维化靶点筛选

数据库共筛选出肾纤维化靶点1358个，通过Venny平台将肾脏纤维化靶点与肾纤康成分靶点取交集，得到潜在作用靶点134个，同时构建“肾纤康治疗肾脏纤维化的调控网络”，见图2。

图2肾纤维化和肾纤康韦恩图及交集网络关系

2.4 PPI 网络及拓扑学分析

将筛选出的134个药物疾病靶点导入Cytoscape进行网络拓扑分析，得到关键靶点31个，并筛选出度值较高的核心靶点进行呈现，说明这些靶点可能是肾纤康防治CKD的关键靶点，见图3。

图3 关键靶点PPI网络图

2.5 GO 和 KEGG富集分析

用Metascape平台对关键靶点进行GO分析和KEGG富集分析，在GO功能富集分析中，获得生物过程（BP）条目979个，细胞组成（CC）条目30个，分子功能（MF）条目124个，依据P值选取每个模块排名前10的条目，绘制的条状图如图4。在KEGG分析中，确定了128条信号通路，其中TGF-β信号通路、HIF-1信号通路值得关注，依据P值选取排名前20的条目见图5。

图4肾纤康抗肾纤维化GO功能富集分析气泡图

图5 肾纤康抗肾纤维化 KEGG 功能富集分析图

3 讨论

在肾纤康抗肾纤维化的网络药理学分析中，肾纤康有效化合物成分77个，其中槲皮素、山柰酚、水蛭素等是关键成分，对应靶点462个，与疾病肾纤维化的共同靶点134个，得到核心靶点IL6、TNF、IL-1β、BMP-7等。其中槲皮素和山柰酚均为黄酮类化合物，具有抗炎[9]、抗氧化[10]、抗肾纤维化[11]等多种作用，槲皮素是肾纤康的君药黄芪、淫羊藿的重要成分，因此推测槲皮素在肾纤康发挥临床疗效中发挥了关键作用，这与文献报道一致[12]；在核心靶点中，IL6、IL-1β、TNF、EGFR均属于炎性因子，在介导肾纤维化中发挥了关键的作用[13-14]，BMP-7则属于TGF-β超家族，也可发挥抗肾纤维化的作用[15]。综上，肾纤康的有效成分和核心靶点能直接发挥抗肾纤维化的作用，且还能通过抗氧化、抑制炎症反应的机制，延缓肾纤维化的进展。在KEGG分析中，筛选出了肾纤康治疗肾纤维化的关键信号通路，主要有TGF-β信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、血脂与动脉粥样硬化以及多种癌症、糖尿病相关通路，均与肾纤维化密切相关，其中TGF-β1/Smads通路是肾纤维化形成的经典途径。

由此，本研究从“药物-疾病-靶点”角度分析复方肾纤康治疗慢性肾脏病的分子机制，说明了肾纤康治疗肾纤维化是多成分、多靶点、多途径共同作用的结果。

参考文献

[1]Yang C, Wang H, Zhao X, et al. CKD in China: Evolving Spectrum and Public Health Implications[J]. Am J Kidney Dis. 2020;76(2):258-264.

[2]Liu Y, Lei H, Zhang W, et al. Pyroptosis in renal inflammation and fibrosis: current knowledge and clinical significance[J]. Cell Death Dis. 2023;14(7):472.

[3]张琼,陈定国,沈宏春.基于肾内微癥积理论探讨中医抗肾纤维化策略[J].四川中医,2014,32(12):24-25.

[4]张琼,胡琼丹,李小军等.肾纤康对肾间质纤维化大鼠Smad信号通路的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2010,11(09):817-819+853.

[5]陈定国.基于Wnt/β-catenin信号通路研究肾纤康颗粒抗肾间质纤维化作用及机制[D].西南医科大学;四川医科大学硕士论文,2015.

[6]范惠.肾纤康通过TGF-β1/Smads信号通路干预肾小管上皮细胞转分化的研究[D]. 西南医科大学硕士论文，2017.

[7]陈定国,梁颖兰,范惠,等. 中药复方肾纤康颗粒抗肾间质纤维化作用研究[J]. 健康之友,2021(1):22-23.

[8]陈海彬,周红光,李文婷,等.网络药理学—中药复方作用机制研究新视角[J].中华中医药杂志,2019,34(07):2873-2876.

[9]叶苗,刘丽仙,梁晓美. 槲皮素对大鼠肾缺血再灌注损伤模型的保护作用 [J]. 中国中西 医结合肾病杂志, 2019, 20(12): 1041-1043.

[10]Al-Khayri JM, Sahana GR, Nagella P,,et al. Flavonoids as Potential Anti-Inflammatory Molecules: A Review[J]. Molecules. 2022;27(9):2901.

[11]Cao Y, Hu J, Sui J, et al. Quercetin is able to alleviate TGF beta-induced fibrosis in renal tubular epithelial cells by suppressing miR-21 [J]. Exp Ther Med, 2018, 16(3): 2442 -2448.

[12]俞鑫伟,姜宁华,滕晓春,等.基于网络药理学和分子对接探究复方积雪草治疗慢性肾病的作用机制[J].中国药理学与毒理学杂志,2023,37(S1):34.

[13]Graterol Torres, F, Molina, Evolving Concepts on Inflammatory Biomarkers and Malnutrition in Chronic Kidney Disease[J]. Nutrients, 2022, 14(20), 4297.

[14]Higgins DF, Ewart LM, Masterson E, et al. BMP7-induced-Pten inhibits Akt and prevents renal fibrosis [J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2017, 1863(12):3095-3104.

[15]Tang PM, Nikolic-Paterson DJ, Lan HY. Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis. Nat Rev Nephrol[J]. 2019;15(3):144-158. 

基金项目：四川省中医药管理局课题（2023MS052）；泸州市人民政府-西南医科大学科技战略合作项目（20212021LZXNYD-D13）；四川省科技计划资助（2022YFS0621）

第一作者简介：辜晓娇，研究生。

通信作者：张琼，教授，主任中医师，博士。