基于CALM/NOS3/PKC介导钙信号通路探讨桂龙护瘘酊治疗动静脉内瘘内膜增生的作用机制

【摘要】目的：本研究观察桂龙护瘘酊（GLHLD）对腺嘌呤大鼠动静脉内瘘血管内膜增生的作用机制，可能通过NOS3介导钙信号通路产生作用。方法：利用套管法建立大鼠颈外静脉-颈动脉内瘘模型。检测大鼠血清肌酐，肾组织Masson染色的病理改变，近吻合口处静脉血管EVG染色观察血管内膜病理变化，免疫荧光法检测吻合处CALM、NOS3、PKC的蛋白表达。结果：血管EVG染色：生理盐水干预组内弹力层结构异常且不连续，可见缺失，大量胶原纤维沉积，明显向管腔内延伸；GLHLD干预组内弹力层结构异常且不连续，可见缺失，大量胶原纤维沉积，明显向管腔内延伸但较模型组程度减轻；免疫荧光：与生理盐水干预组相比，GLHLD干预组NOS3荧光强度升高(p＜0.05)；CALM、PKC荧光强度降低(p＜0.05)。结论：桂龙护瘘酊能够改善大鼠动静脉内瘘内膜增生和细胞增殖，可能与抑制NOS3介导钙信号通路上调NOS3和下调CALM、PKC表达有关。

关键词：桂龙护瘘酊；NOS3；钙信号通路；动静脉内瘘；血管内膜增生

[基金项目]：2024年贵州省大学生创新创业训练计划项目（S2024106621512）

[作者]李欣奇，男，本科在读。

[通讯作者]谢娟，女，主任医师，硕士生导师，中西医结合防治肾病。

慢性肾衰竭为临床常见病，其病理机制为在原发或继发性致病因素作用下，肾脏组织损伤、实质萎缩及功能减退，终致终末期肾衰竭。我国本病患病率高于全球平均水平，血液透析率逐年上升，动静脉内瘘为最常用血管通^[1,2]。

血管内皮型一氧化氮合酶（NOS3）催化生成NO，具有保护血管、促生成及舒张作用，其表达异常可致内皮损伤^[3]。钙调蛋白（CALM）作为钙离子传感器，调控平滑肌细胞弹性与黏附^[4]。蛋白激酶C（PKC）参与细胞增殖、分化、凋亡及血管生成，并通过钙离子调节等途径影响血管平滑肌收缩^[5]。中医学虽无“自体动静脉内瘘”之载，但据其术后狭窄、血栓等表现，可归为“脉痹”范畴，病机为血脉壅涩，治以通脉为要。AVF建立过程属“金刃”所伤，脉道受损，营卫失和，致血行不畅成瘀。本团队基于“治未病”“络道亢变”理论，运用温经通脉法研制桂龙护瘘酊，肉桂、地龙、红花、乳香、没药五味药组成。方中肉桂辛热散寒、温经通脉，地龙咸寒善走窜、通经活络，共为君药；红花活血通经为臣药；乳香、没药活血定痛、行气散瘀，共为佐药，共奏温经通脉、活血祛瘀、散寒止痛之功^[6]。临床与实验研究证实其可抑制内膜增生、促进AVF成熟、提高通畅率，机制与调控NOS3基因等多通路相关，尚需深入探索。

实验材料

1主要实验器材：8-0带线缝合针、4-0丝线编织非吸收性缝线：宁波医用缝针有限公司；显微止血夹：上海医疗器械有限公司手术器械厂；一次性使用静脉留置针：山东朱氏药业集团。

2主要试剂：酶联免疫吸附（ELISA）、HE染液套装、EVG染液套装、盐酸、氨水、冰醋酸、中性树胶、荧光二抗、抗荧光淬灭封片剂。

3实验方法

3.1实验动物

动物选取SPF级6周龄雄性SD大鼠32只，体重180～200g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK(京）2019-0008。饲养于温度控制（20-26℃）、湿度调节（40%-70%）的SPF级屏障环境中，自由摄取食物及饮用水。

3.2动物分组

自北京华阜康生物科技股份有限公司购进SPF级(180～200g)6周龄雄性SD大鼠32只。使用随机数表法分为：正常组、假手术组、生理盐水干预组、GLHLD干预组各8只。

3.3受试药品

桂龙护瘘酊由肉桂、地龙、乳香、没药、红花共5味中药组成。选取同一批号的优质、道地药材，经CO2超临界萃取法及低温动态法提取而成。所有运用于本实验的桂龙护瘘酊均由我院肾内科血透室统一提供。腺嘌呤：索莱宝生物科技公司。

4造模方法

4.1慢性肾功能衰竭大鼠模型建立

所有实验动物于动物房适应性饲养一周后，除正常组外，其余各组所有大鼠均使用腺嘌呤建立慢性肾功能衰竭模型。将1g腺嘌呤溶解在40mL生理盐水中，制成浓度为2.5%的腺嘌呤混悬液，以250mg/(kg·d)持续28天^[7]定时给大鼠灌胃给药；期间正常摄取饲料及饮用水。

4.2大鼠动静脉内瘘模型建立

基于前期模型建立一周后，生理盐水组与桂龙护瘘酊组大鼠予1%戊巴比妥钠（60 mg/kg, IP）腹腔注射麻醉，颈部备皮，行颈正中偏右斜切口约1.5 cm。游离并切除右侧胸锁乳突肌及颌下腺，分离右侧颈外静脉，结扎并游离静脉桥，远端结扎，管腔以5000 U/L肝素钠生理盐水冲洗。分离右侧颈总动脉，近端以血管夹阻断血流，远端结扎；将24G留置针修剪至合适长度后套入动脉，翻转动脉并套于自制套管上，以8-0缝线结扎，肝素生理盐水冲洗管腔后插入静脉桥，以8-0缝线双重结扎，缝合切口^[8，9]。假手术组仅游离血管后缝合，正常组不予处理。吻合成功标志：吻合口震颤良好。

4.3药物干预

基于前期研究，术后6小时起，桂龙护瘘酊组与生理盐水组分别予0.01 mL/g/次涂抹内瘘区域，每日1次，连续28天；正常组与假手术组不予处理。

5取材及检测

5.1标本取材及制备

各组大鼠于术后28天取材处死^[10]。麻醉后固定，经腹主动脉采血，3000 r/min离心10 min，取上层血清分装，-40℃保存。行血流夹断通畅实验后，截取吻合口近端静脉段，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制成5μm连续切片。肾脏及血管组织标本以4%中性缓冲甲醛固定，4℃保存备用。

5.2 ELISA检测血清肌酐水平

在完成28天的药物干预后，大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠（0.20 mL/只）麻醉，通过腹主动脉穿刺采集全血样本，3000r/min离心10 min分离血清，测定血肌酐浓度。

5.3 Masson染色观察肾脏病理

石蜡组织切片脱蜡、冰冻切片复温固定，苏木精-伊红（HE）染色，脱水、透明，中性树脂封片。显微镜下观察，获取图像并进行分析。

5.4 EVG染色观察观察血管内膜病理变化

石蜡组织切片脱蜡、冰冻切片复温固定，苏木精-伊红（HE）染色，脱水、透明，中性树脂封片。显微镜下观察，获取图像并进行分析。

5.5免疫荧光方法检测吻合口处内膜上CALM/NOS3/PKC蛋白质表达

免疫组化：切片脱蜡、抗原修复、封闭、一抗二抗孵育、DAB显色、复染、封片、镜检。免疫荧光：切片脱蜡、抗原修复、封闭、一抗二抗孵育、DAPI复染、封片、镜检分析。

6统计学方法

采用GraphPad Prism10软件分析，结果以（`x±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。经正态性与方差齐性检验后，采用单因素方差分析，方差不齐则行秩和检验。

实验结果

1大鼠一般情况

24只大鼠行内瘘手术，假手术组与GLHLD干预组各死亡1只，死因为感染及抓挠致失血；余鼠愈合可，吻合口震颤佳，无异变。

2血清肌酐检测结果

与正常组相比，假手术组、生理盐水干预组、GLHLD干预组大鼠Cr升高，具有统计学意义(p＜0.05）（表1）。

表1腺嘌呤致大鼠慢性肾衰竭模型Cr结果（`x±s）

注：与正常组比较*p<0.05。

3肾脏组织Masson染色结果

Masson染色：正常组、假手术组纤维完整、排列整齐；假手术组、生理盐水组、桂龙干预组血管壁扩张，纤维撕裂、排列紊乱（图1）。

图1肾脏组织Masson染色（×200）

注：A-正常组；B-假手术组；C-生理盐水干预组；D-GLHLD干预组。

4血管EVG染色结果

EVG染色显示：正常组与假手术组弹力纤维致密规则，结构完整连续，胶原无沉积；生理盐水组弹力层断裂缺失，胶原大量沉积并向管腔内延伸；GLHLD干预组上述病变减轻（图2）。

图2血管组织EVG染色(×200)

注：A-正常组；B-假手术组；C-生理盐水组；D-桂龙护瘘酊干预组。

5免疫荧光检测大鼠血管组织CALM/NOS3/PKC蛋白表达情况

免疫荧光显示：桂龙组较生理盐水组NOS3表达增强，CALM、PKC减弱（P＜0.05）；各干预组较正常组及假手术组NOS3表达降低，CALM、PKC升高（P＜0.05）（图3）。

图2血管组织EVG染色(×200)

注：A-正常组；B-假手术组；C-生理盐水组；D-桂龙护瘘酊干预组。

讨论

慢性肾功能衰竭是由多种慢性肾脏疾病进展所致的临床综合征，以肾功能进行性减退及多系统受累为特征^[11]。动静脉内瘘是终末期肾病维持性血液透析患者的首选血管通路^[12]，但其成熟障碍仍是核心临床挑战。术后12周内因发育不良无法达标即判为成熟失败^[13]，静脉内膜过度增生并继发狭窄是其主要病理学原因之一^[14]。本研究采用腺嘌呤灌胃28天建立慢性肾衰竭大鼠模型，模拟尿毒症患者内瘘术前状态，增强临床相关性^[15]。动静脉内瘘模型选用啮齿类动物导管法，其成功率高、并发症少，方案可靠^[26]。

本研究免疫荧光显示，与生理盐水组相比，桂龙护瘘酊干预显著抑制了动静脉内瘘静脉组织中CALM与PKC的表达，并促进了NOS3的表达。这一发现从蛋白水平揭示了桂龙护瘘酊的作用靶点。CALM作为关键的钙信号传感器，其与Ca²⁺结合后可激活下游多种效应蛋白。血管平滑肌中，Ca²⁺/CALM经PKC-MAPK通路驱动VSMCs增殖迁移，致内膜增生；eNOS/NO则抑制此过程。PKCδ双向调控VSMCs与eNOS功能。桂龙护瘘酊或通过上调eNOS、下调CALM/PKC，抑制VSMCs异常增殖、改善内皮功能，从而缓解内膜增生^[17]。

综上所述，桂龙护瘘酊可延缓动静脉内瘘内膜增生，其机制与调控NOS3介导的钙信号通路、上调NOS3并下调CALM及PKC表达有关。该复方成分复杂，核心药效物质及潜在机制尚待深入探索。

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