毛蕊异黄酮通过Foxp3和miR-375的相互作用抑制乳腺癌迁移的研究

【摘要】目的：研究显示，毛蕊异黄酮抑制了乳腺癌细胞的生长并诱导了细胞凋亡。然而，毛蕊异黄酮对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响以及潜在的分子机制尚未明确。该研究探讨了毛蕊异黄酮对乳腺癌细胞生长的影响及可能的途径。方法 采用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验，测定了高剂量（50、100或150μM）毛蕊异黄酮对人乳腺癌细胞MCF-7迁移和侵袭的抑制作用，通过实时定量PCR测定MCF-7细胞中Foxp3、miR-375和MMP-9的相对表达水平。结果 高剂量毛蕊异黄酮以剂量依赖的方式抑制了MCF-7细胞的迁移和侵袭。此外，高剂量毛蕊异黄酮显著降低了MCF-7细胞中Foxp3的表达，随之下调了miR-375和MMP-9的表达。结论 毛蕊异黄酮可以通过靶向Foxp3、miR-375的表达，降低癌细胞迁移和侵袭。

【关键词】毛蕊异黄酮; Foxp3; miR-375; 乳腺癌; 细胞迁移

与北美和欧洲的人相比，东亚国家的癌症发病率低得多，这部分归因于东亚人饮食中植物雌激素的摄入量较高。植物雌激素分子结构与雌激素相似，并证明对癌细胞具有类固醇效应。植物来源的植物雌激素分为四大类：异黄酮、香豆素、木酚素和皂角苷。大豆食品与较低的癌症率相关，因为它含有高水平的异黄酮。以前的大多数研究已经证实，毛蕊异黄酮对乳腺癌细胞在体外增殖有抑制作用[1]。Foxp3最初被认为仅表达在Tregs中，最近也在癌症中表达。研究发现，Foxp3在癌症中高度表达，癌症组织中高表达与各种癌症患者的不良预后有关[2]。同时，Foxp3已被确定在癌症中可以调节基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，特别是Foxp3通过上调MMP-9的表达量促进结肠癌的迁移和侵袭。因此，本实验探究毛蕊异黄酮通过Foxp3介导的信号通路对乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用。在前期研究中，miR-375在乳腺癌组织中较正常乳腺组织中的表达量升高[3]，miR-375表达上调对癌变有深远影响。毛蕊异黄酮可能通过调节Foxp3和miR-375的表达来抑制乳腺癌细胞的侵袭，为乳腺癌治疗提供了新的视角。

1实验材料和方法 

1.1细胞培养

MCF-7细胞为中国科学院上海细胞生物学研究所培养，培养条件为37℃、5% CO2的恒温细胞培养箱。

1.2细胞划痕实验

MCF-7细胞在对数生长期被消化，离心，重悬，然后均匀接种在6孔板中。细胞生长24小时后，用10ul移液枪尖垂直划过细胞，清洗细胞。不同浓度（0、50、 100、150μM）的毛蕊异黄酮处理细胞，并在药物处理后不同时间点（0、24小时）拍照细胞图像。实验各自重复三次。

1.3Transwell实验

MCF-7细胞迁移实验中，使用24孔Transwell室（孔径8μm；Millipore，Billerica，MA，USA），其中上室接种1×105细胞/孔，经过血清饥饿处理后，加入不同浓度（0、50、100、150μM）毛蕊异黄酮。将含有20% 血清的DMEM培养基填充在下室中，然后将细胞置于37℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中进行培养。培养结束后，将下室表面的迁移细胞用4%甲醛固定，使用结晶紫对迁移细胞进行染色，随机选择每孔5个区域，进行细胞计数。重复以上步骤三次。

1.4PCR实验

细胞均匀接种于6孔板中，用不同浓度（0、50、100、150μM）毛蕊异黄酮处理24小时。使用Tritol试剂（Invitrogen，Carlsbad，California，USA）从细胞中提取总RNA。使用了荧光定量PCR试剂盒（SYBR Green Mix，Roche Diagnostics），β-actin作为内参，根据制造商的说明，在Light Cycler 480（Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana，USA）上设置实验参数检测基因表达。实验各自重复三次。

2统计分析

使用SPSS20.0处理分析数据，计量数据以（`x±s）表示，用单因素方差分析（ANOVA）检验组间差异。p＜0.05被认为具有统计学意义。

3结果

3.1 毛蕊异黄酮抑制MCF-7细胞的迁移

乳腺癌细胞MCF-7用较高剂量的毛蕊异黄酮（50、100和150 μM）处理0和24小时后，进行了细胞划痕实验和Transwell实验。用较高剂量毛蕊异黄酮处理的细胞24小时的伤口宽度显示出明显的剂量依赖性，而对照组的伤口宽度随着时间的推移逐渐减小（图1）。Transwell结果显示，较高浓度（50、100和150 μM）的毛蕊异黄酮显著降低了MCF-7细胞的迁移率（图2）。因此，我们的结果表明，较高剂量的毛蕊异黄酮抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

图1 毛蕊异黄酮通过细胞划痕实验抑制MCF-7细胞的迁移

注：使用单因素方差分析法进行多组间数据比较，#p <0.01，与对照组（0 μM）相比。

图2 毛蕊异黄酮通过Transwell实验抑制MCF-7细胞的迁移

注：MCF-7细胞用不同浓度的毛蕊异黄酮处理24小时。#p <0.01，与对照组（0 μM）相比。

3.2毛蕊异黄酮上调MCF-7中miR-375的表达

不同浓度（0、50、100、150 μM）毛蕊异黄酮处理MCF-7细胞48小时，以研究毛蕊异黄酮的潜在机制。通过实时定量PCR评估细胞中miR-375的表达水平，显示出剂量依赖性上调（图3）。

图3 毛蕊异黄酮上调MCF-7细胞中miR-375的mRNA表达水平

注：通过实时定量PCR测定miR-375的mRNA水平，β-actin作为内参。*p<0.05，#p <0.01，与对照组（0 µM）比较。

3.3毛蕊异黄酮在MCF-7细胞中下调Foxp3的表达水平

MCF-7细胞分别用不同浓度的毛蕊异黄酮（0、50、100、150μM）处理48小时。通过实时定量PCR实验检测细胞中Foxp3的表达水平，Foxp3 mRNA的表达水平显示出剂量依赖性的降低（图4）。

图4 毛蕊异黄酮下调MCF-7细胞中Foxp3的mRNA表达水平

注：通过实时定量PCR测定Foxp3的mRNA水平，并以β-actin作为内参。*p<0.05，#p <0.01，与对照组（0 μM）相比。

3.4毛蕊异黄酮在MCF-7细胞中下调MMP-9的表达水平

使用不同浓度的毛蕊异黄酮（0、50、100、150μM）处理MCF-7细胞48小时。通过PCR实验检测细胞中MMP-9的表达水平，MMP-9 mRNA的表达水平显示出剂量依赖性的降低（图5）。

图5毛蕊异黄酮下调MCF-7细胞中MMP-9的mRNA表达水平

注：通过实时定量PCR测定细胞中MMP-9的mRNA水平，并以β-actin作为内参。*p<0.05，#p <0.01，与对照组（0 μM）相比。

4讨论

毛蕊异黄酮是黄芪中的一种植物雌激素，显示其在乳腺癌治疗中的应用潜力[4]。鉴于人类乳腺癌细胞MCF-7中高水平的雌激素表达，本研究主要探讨了毛蕊异黄酮对MCF-7细胞迁移和侵袭的影响。

在前面的实验中，乳腺癌细胞的增殖和凋亡与毛蕊异黄酮的剂量有关，低剂量的毛蕊异黄酮会促进其生长，而高剂量的毛蕊异黄酮则会抑制。这可能与不同剂量毛蕊异黄酮具有雌激素或抗雌激素活性有关。因此，在本研究中，我们选择了较高浓度的毛蕊异黄酮进行实验。细胞迁移和侵袭是肿瘤发展和转移所必需的过程，然而，关于毛蕊异黄酮对乳腺癌细胞侵袭和迁移的潜在机制的报道有限。在本研究中，发现毛蕊异黄酮可能具有潜在的抗肿瘤应用。

已经记录到MMP9与乳腺癌转移和侵袭呈正相关，但机制尚不清楚[5]。而且最近的一些研究表明，一些植物雌激素可以降低乳腺癌细胞中MMP-9的表达，并抑制癌细胞的迁移和侵袭[6]。因此，我们首先研究了毛蕊异黄酮是否对MMP-9有类似的影响。研究表明，癌细胞中Foxp3的表达水平与MMP-9呈正相关，这可能与某些与细胞因子有关。因此，我们研究了毛蕊异黄酮处理后的MCF-7乳腺癌细胞中Foxp3的水平。结果显示，高剂量毛蕊异黄酮处理组中Foxp3的水平和MMP-9的表达水平是一致的。我们认为MMP-9表达水平的降低可能与Foxp3表达的下调有关。

研究表明，Foxp3与乳腺癌患者的预后呈负相关[7]。同时，还证明了用毛蕊异黄酮下调Foxp3的表达抑制乳腺癌细胞。这些结果表明Foxp3参与乳腺癌细胞的迁移和侵袭，且Foxp3可以作为促肿瘤因子。据研究，恶性肿瘤中miR-375的低表达可以促进肿瘤细胞的增殖和侵袭，而高表达的miR-375具有抗肿瘤作用[8]。因此，miR-375有可能成为肿瘤的治疗靶点和预后标志物。Foxp3高表达组中miR-375的表达水平低，表明Foxp3和miR-375表达之间存在负相关关系。

5结论

我们的结果显示，高剂量（50、100、150µM）的毛蕊异黄酮通过抑制Foxp3表达并通过促进miR-375的表达，从而抑制MCF-7乳腺癌细胞的迁移和侵袭。这些结果为为毛蕊异黄酮在乳腺癌的临床应用中提供了新的选择。

参考文献

[1]田晶,Foxp3促进乳腺癌细胞增殖、凋亡和侵袭迁移能力的研究.广西壮族自治区,桂林医学院,2018-02-11.

[2] Saleh R, Elkord E. Foxp3+ T regulatory cells in cancer: Prognostic biomarkers and therapeutic targets[J]. Cancer letters, 2020, 490: 174-185.

[3] Lisencu L A, Roman A, Visan S, et al. The Role of miR-375-3p, miR-210-3p and Let-7e-5p in the Pathological Response of Breast Cancer Patients to Neoadjuvant Therapy[J]. Medicina, 2022, 58(10): 1494.

[4]Li Y, Miao H, Wei W, et al. Inhibitory effect of calycosin on breast cancer cell progression through downregulating lncRNA HOTAIR and downstream targets: HuR and IGF2BP1: Calycosin inhibits breast cancer growth by regulating HOTAIR[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2023, 55(2): 225.

[5] Dofara S É È G, Chang S L, Diorio C. Gene polymorphisms and circulating levels of MMP-2 and MMP-9: a review of their role in breast cancer risk[J]. Anticancer Research, 2020, 40(7): 3619-3631.

[6] 李鑫.毛蕊异黄酮对乳腺癌细胞增殖的影响及其作用机制的探讨[D].桂林医学院,2017.

[7]Liu C, Han J, Li X, et al. Foxp3 inhibits the metastasis of breast cancer by downregulating the expression of MTA1[J]. Frontiers in Oncology, 2021, 11: 656190.

基金资助：1.湖南省自然科学基金，2021JJ40384；2湖南省教育厅优秀青年项目，21B0906。