无菌药物生产环境中微生物的检测及控制研究

摘要：本文就无菌药物生产过程中的微生物检测技术现状、进展和面临的挑战以及其配套的预防与控制措施进行系统性的探讨。在采用快速微生物检测技术(例如ATP生物发光法、核酸扩增法等)的基础上，通过基于风险的环境监测点的选择和优化、趋势图和预警控制等统计方法的应用，以及厂房设计、人员行为、消毒灭菌程序和环境监测的闭环控制，更加积极和智能地对微生物污染进行防控。这将不仅有利于当前无菌药物生产的微生物检测和控制，而且将为制药企业应对未来愈加严格的法规和技术创新打下基础。
关键词：无菌药物；生产环境；微生物；监测控制
前言：随着《药品生产质量管理规范》不断完善，以及国内外药典、药品监管部门对无菌产品的要求不断提高，传统的制药环境监控方法已经难以适应新的要求。一方面，微生物污染物具有隐匿性、随机性、低概率性，传统的沉降菌法、浮游菌法和表面微生物监测方法，能起到预防和控制污染的作用，但也有监测滞后、代表性差的缺点；另一方面，新的耐药菌、不可培养的微生物和更小粒径的微粒，可能成为传统方法的"盲点"。另外，洁净室动态生产过程中的人工作业、设备运行、物料传输等，也带来了人员携带微生物、微粒控制等方面的新的风险。因此，建立和维持一个受控、持续符合无菌要求的洁净生产环境，是制药生产的底线。为此本文针对无菌药物生产环境中微生物的检测及控制进行研究。

1无菌药物生产环境中微生物的检测技术

1.1传统培养法

传统培养法在无菌药物生产环境的微生物检测中面临许多挑战。传统培养法是将所取样的物品接种在适当的培养基中，于一定的温度、湿度等条件下培养，使其中的微生物的生长、繁殖，最终形成可见的菌落，然后根据菌落的数量来判定环境中的微生物水平。其优点是检测方法的准确性高，能够反映出样品中能够培养的微生物的品种和数量。用传统培养法对一般细菌、真菌等效果较好，是目前许多制药企业进行微生物质量控制的基础方法。缺点是花费时间长，一般需要3～5天甚至更长的时间培养，不能及时发现微生物污染。同时传统培养法只能检测出来适合在当前培养条件下生长的微生物，存在监测盲点，不能检测出一些不能生长的微生物如处于休眠状态的微生物^[1]。

1.2ATP生物发光法

ATP生物发光法是一种用以测定微生物的新型方法（如图1所示）。它是利用荧光素酶催化荧光素和ATP发生反应而产生生物发光，通过测定发光强度间接反映出样品中微生物的含量，因为所有活的微生物细胞内都含有ATP，所以可以用来测定样品中活的微生物总量。其优点是测定速度快，一般几分钟即可得出结果，缩短了分析时间，有利于及时发现和查找微生物污染的原因，采取对策。其手续简单，无培养过程。ATP生物发光法也有其不足之处，只能测出微生物的总量，不能测出微生物的种类，另外样品中的某些杂质也会影响测定结果，需要预先对样品进行处理。

图1 ATP生物发光法工作流程

1.3PCR法

PCR方法是一种建立在核酸扩增基础上的分子生物学检测技术。通过设计特定的引物，特异地扩增样本中微生物DNA或mRNA序列，然后通过对扩增产物的检测推断微生物的存在和种类。PCR方法具有灵敏度高、特异性强的优点，可以检测到样品中极少的微生物核酸，甚至可以检测到用培养法无法检测到的微生物。PCR方法可以快速而准确地鉴定微生物的种类，对于一些难以培养或生长缓慢的微生物的检测具有明显优势。但是，PCR方法对实验条件要求较高，需要有严格的无菌操作和贵重的仪器设备，防止核酸的污染而导致假阳性结果，而且，PCR方法只能表明样品中是否含有某种特定的核酸序列，而不能判断微生物的活性^[2]。

1.4空气微生物采样检测技术

无菌药物生产过程中，对空气中的微生物的采样检测显得尤为重要。常用的空气微生物采样方法有撞击法、过滤法及沉降法等。撞击法是依据空气动力学原理，使空气中的微生物粒子撞击在培养基表面，然后收集培养、计数。该方法采样效率高，能够比较准确地反映空气中的微生物浓度和粒径分布。过滤法是将空气通过无菌过滤膜捕集其中的微生物粒子，然后将过滤膜转移到培养基上进行培养。该方法适用于采集空气中的微小微生物颗粒。沉降法是将无菌的培养基暴露于空气中一定时间，使空气中的微生物沉降于培养基表面，然后收集培养、计数。该方法操作简单，但采样效率低，只能反映空气中的较大颗粒微生物的沉降情况。采用适当的空气微生物采样方法，能够及时发现生产环境中空气的微生物污染情况，采取有效的净化和消毒措施，保证无菌药物的生产质量。

2无菌药物生产环境中微生物的控制手段

2.1洁净环境设计与动态控制

无菌药物生产的屏障在于环境，必须采用科学合理的设计和严密有效的控制，生产场地洁净度必须依据国家有关规定划分等级，通过精密的空气处理系统对洁净室(洁净区)洁净空气进行严格控制，向洁净室(洁净区)提供经高效过滤器处理的干净、无颗粒、无微生物的空气；保持梯级压差，使洁净空气从高级别洁净区间低级别区域单向流动，防止污染空气倒灌；对于灌装、加塞等洁净要求高的操作点，设置垂直层流罩，形成单向、均匀的高速洁净气流，包围操作者，及时吹散操作产生的微粒。环境的保障不仅依靠设计，还必须通过对环境的持续验证与监测来实现，定期对悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物等项目进行采样检测，各项检测数据必须持续在验证时确定的合格水平，这样才构建起防污染和交叉污染的第一道屏障^[3]。

2.2人员无菌规范与行为管理

人员是洁净室内最活跃的，也是最主要的污染源，因此对人员的各种行为实施严格的控制是微生物控制的关键，所有进入洁净区的人员都必须经过逐级更衣程序，穿着经灭菌、无脱落、包裹紧密的洁净服，手多次消毒后进入洁净区，更重要的是对人员的无菌意识及行为实施持续的培训和监控。操作人员必须时刻牢记"最小干预"原则，一切动作都应舒缓、从容，避免大幅度转身、大声讲话或其他不必要转身、移动，以减少人体散发的颗粒和微生物。不允许裸手直接接触任何产品、内包材或设备关键表面，必须戴无菌手套并且定时消毒。在适当位置安装更衣镜、设置行为监督员或定期进行表面微生物接触碟检测等，以持续保证行为的合规性，从而最大限度地降低人为污染^[4]。

2.3物料与设备的灭菌保障

所有进入无菌核心区的物料(含器材、耗材、化学试剂、培养基等)和设备，必须在使用前经由经过验证可靠的灭菌或除菌程序处理，以杀灭或去除其附着的微生物。根据不同物料的性质，必须使用经验证适当的灭菌程序: 对于耐热、耐湿的物品，首选湿热灭菌，因其具有强烈的穿透力和杀灭微生物的高效力；对于热不稳定的液体必须使用除菌级过滤；对于不耐热塑料的组件或一次性系统，可使用辐射灭菌；干热法常用于去除非一次性使用玻璃容器中的热原。每种灭菌程序都必须使用生物指示剂进行挑战性验证，以证明达到了无菌保证水平。系统还应采用尽可能多的在线清洁与在线灭菌的设计，以减少拆装过程带来的污染^[5]。

2.4清洁消毒程序与微生物监测

无菌药物生产需建立并有效执行一套基于科学依据且可验证的程序来控制环境表面的微生物滋长、预防交叉污染，清洁和消毒是控制环境表面微生物滋长及交叉污染的最有效的方法。清洁是通过物理的方法去除设备和表面上的有机物，消毒是在清洁之后通过化学的方法杀灭残留的微生物。不同类型的洁净区应轮换使用不同的消毒剂以防微生物对抗性的产生。所有清洁和消毒程序都应明确规定所使用的消毒剂的配置浓度、作用时间、应用方法和频率，同时通过环境表面微生物监控来验证其效果。清洁消毒程序与环境和人员监控相结合，形成一个动态的微生物监控体系。该体系持续收集数据，并依据设定的警戒限和行动限进行趋势分析，能及时预警并识别偏差，继而通过纠正与预防措施，实现对生产环境微生物状态的持续有效控制^[6]。

结束语：无菌药物生产环境中的微生物控制，是一个包含设计、执行、监控与改进环节的闭环管理活动。回顾无菌药品生产环境微生物监控手段的发展，其方法论呈现出从事后监控向早期预警与风险预防转变的趋势。这意味着有效的微生物控制并非单纯追求检测灵敏度，而是致力于构建一个多层次的主动防护体系，包括：科学的洁净室设计与受控气流、严格的人员培训与行为规范、经过验证的清消程序、以及一个能基于数据趋势进行动态风险监控的环境监控程序。这些环节环环相扣，共同保障生产环境微生物处于持续受控状态。
参考文献

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[2]赵丽元,丁红雨,高洪霞,等. 环境微生物数据库的建立及在溯源分析中的应用[J].中国药业,2022,31(23):84-88.

[3]宋艳梅,夏忠悦,骆敏,等. 食品生产加工过程中环境微生物的监测与控制[J].食品安全导刊,2022,(24):41-43.DOI:10.16043/j.cnki.cfs.2022.24.039.

[4]曾文炉,马维琦,陈翠红.环境生态学与环境生物学实验[M].化学工业出版社:202208:198.

[5]刘嘉良. 无菌药物生产环境中微生物的检测及控制研究[J].科技资讯,2018,16(18):246-247.DOI:10.16661/j.cnki.1672-3791.2018.18.246.

[6]高丽莹. 无菌药物生产环境中微生物的检测及控制研究[J].黑龙江科技信息,2017,(04):145.