表没食子儿茶素通过抑制NF-κB信号通路改善PCOS大鼠卵巢炎症微环境

【摘要】 目的：探讨表没食子儿茶素（EGCG）对PCOS大鼠卵巢炎症微环境的影响。方法  70只大鼠被随机分成空白对照组（10只）和造模组（60只）。DHEA皮下连续注射21天建立PCOS大鼠模型，造模成功后EGCG灌胃治疗40天，治疗结束后监测大鼠动情周期；记录大鼠体重和双侧离体卵巢重量；HE染色光镜下观察卵巢形态学改变；IHC检测EGCG对NF-κB p65，MyD88和TLR4蛋白表达的影响；IF检测EGCG对NF-κB p65核转位的影响。结果  与空白对照组相比，DHEA诱导组大鼠发情周期紊乱，卵巢呈囊泡样改变，卵巢重量显著增加（P<0.05）。EGCG灌胃治疗40天后，与Model组相比，部分大鼠发情周期恢复(54.5%)，卵巢重量下降（P<0.05）；HE染色显示卵巢囊泡样扩张显著减少，颗粒细胞数量增多；EGCG治疗组NF-κB p65、MyD88和TLR4的蛋白表达水平降低；同时NF-κB p65核转位被抑制。 结论  EGCG可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路改善DHEA诱导得PCOS大鼠卵巢炎症状态。

【关键词】 多囊卵巢综合征；EGCG；炎症； NF-κB信号通路

多囊卵巢综合征（PCOS）在育龄妇女中发病率是7%～9%，是影响育龄妇女生育最常见的内分泌和代谢紊乱疾病之一[1]。PCOS的临床症状主要包括严重的排卵障碍、高雄激素血症、卵巢多囊样改变和胰岛素抵抗等。研究表明，慢性炎症是PCOS的主要病因之一。慢性炎症可导致内皮功能障碍、排卵失败、激素内分泌异常以及胰岛素抵抗[2-4]。此外，在PCOS大鼠模型和患者中也观察到几种促炎细胞因子的显著升高[5, 6]。炎症贯穿PCOS的发生发展过程。改善卵巢炎症微环境可能是治疗多囊卵巢综合征的有效方法之一。

表没食子儿茶素（EGCG）是绿茶提取物茶多酚的主要成分，至少占绿茶总成分的50%（7.1 g/100 g茶叶）[7]。越来越多的临床研究表明，EGCG对多类疾病有治疗作用，包括肥胖、代谢综合征、神经退行性疾病、炎症性疾病和癌症等[8-12]。EGCG的生物活性主要包括抗氧化应激、抗炎、抗增殖和促凋亡。鉴于EGCG的生物学活性和显著的治疗作用，本研究中我们探讨EGCG对PCOS是否具有抗炎作用。

1 材料和方法

1.1实验材料

1.1.1 主要药物和试剂

脱氢表雄酮（DHEA）购自广东和为医药科技有限公司，EGCG（纯度≥98%）购自北京索莱宝科技，二甲双胍购自上海施贵宝制药有限公司，TLR4(多克隆兔抗鼠，AF7017-50)、MyD88(多克隆兔抗鼠，AF5195-50)、NF-κB p65(多克隆兔抗鼠，AF5006-50)抗体、荧光二抗（S0008）购自江苏亲科生物研究中心有限公司。

1.1.2实验动物

70只21日龄 Wister大鼠于SPF环境中饲养，给予12 h/12 h昼夜循环交替，自由饮水摄食。

1.2实验方法

1.2.1建立PCOS大鼠模型：70只21日龄 Wister大鼠随机分成2组，空白对照组10只，DHEA诱导造模组60只，颈背部皮下注射DHEA (6 mg•100 g-1•d-1 +200 μl 芝麻油），每日1次，连续注射21天，每日注射前称重。注射完成后，每日行阴道粘液涂片瑞氏染色并在显微镜下观察，连续15 d。根据细胞类型判断动情周期，如完全失去周期性变化，提示建模成功。

1.2.2实验分组：选出建模成功的PCOS大鼠（32只）随机分成3组，Model组10只，EGCG组11只，二甲双胍组11只。EGCG组和二甲双胍组分别给予EGCG (10mg/100g/d)和二甲双胍(14mg•100 g-1•d-1 ）灌胃40 d，空白对照组和Model组给予等体积无菌注射用水灌胃，每日1次，连续40 d，每日灌胃前称重。空白对照组、DHEA诱导组、EGCG组和二甲双胍组大鼠均行阴道涂片，记录动情周期，连续10 d。实验结束后，戊巴比妥钠（100 mg/kg）腹腔过量麻醉处死，卵巢称重，4 %多聚甲醛中固定，并用于后续实验。

 1.2.3HE染色：卵巢组织多聚甲醛固定48 h后，乙醇脱水，石蜡包埋，以5μm厚度切片，苏木素-伊红染色，光学显微镜下观察卵巢形态。

1.2.4免疫组化：组织切片放入60℃恒温箱中30min，再依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液、无水乙醇、95％酒精、90％酒精、85％酒精、75％酒精中进行脱水处理；高温下EDTA溶液修复抗原，再用3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶活性，PBS缓冲液充分洗涤，分别加入稀释的兔抗TLR4（1：100）、MyD88（1：200）、NF-κB p65（1：100）抗体，4℃过夜孵育，PBS溶液洗涤后加入兔二抗（稀释比1:100），37℃孵育50min，DAB显色，苏木素核复染，脱水，封片，显微镜下采集图像并分析。

1.2.5免疫荧光：常规石蜡切片脱蜡至水，BSA封闭，稀释兔抗鼠NF-κB p65抗体（1：200） 37℃孵育2 h，FITC标记的羊抗兔荧光二抗（1：200）室温孵育1 h，DAPI染细胞核避光孵育15min。激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.2.6统计分析

采用SPSS 22.0软件对实验结果进行统计分析。定量资料以均值±标准差（x̄±s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2  结  果

2.1大鼠动情周期监测

动情前期以圆形有核上皮细胞为主，动情期以有核不规律的角化细胞为主，动情后期可见角化细胞，白细胞，有核上皮细胞，动情间期以大量的白细胞为主，提示动情周期规律，而DHEA诱导造模组中31只大鼠动情周期不明显，大部分以有核圆细胞和白细胞为主，提示无排卵，造模成功。经过40 d EGCG和二甲双胍灌胃治疗，3组大鼠动情周期恢复率分别为Model组20.0 %（2/10），EGCG组54.5 %（6/11），二甲双胍组63.6 %（7/11）（图1A）。

A：大鼠动情周期恢复比较； B：大鼠体重变化；C：大鼠双侧离体卵巢重量，与Model组比较，*P<0.05。

图1   各组动情周期、体重和卵巢重量结果

2.2各组卵巢形态学观察

肉眼观Model组卵巢体积较其他3组明显增大，色苍白，表面呈囊泡状改变。HE染色光镜下Model组多数卵泡呈囊泡样扩张，腔内充满液体，闭锁卵泡数增多，同时伴有颗粒细胞层数减少，EGCG和二甲双胍治疗组可见不同发育期的卵泡，包括原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡和成熟卵泡，卵泡颗粒细胞排列规则，层数较多，如图2所示。4组大鼠体重量和卵巢重量结果显示，大鼠体重4组间无明显差异（P>0.05，图1B），卵巢重量与空白对照组比较，Model组显著增加（P < 0.05，图1C），EGCG和二甲双胍组卵巢重量显著低于Model组（P < 0.05，图1C）。

CL：黄体；CF：囊泡； PF：始基卵泡； PrF：初级卵泡； SF：二级卵泡；AF：闭锁卵泡。

A：X 4 ，B：X 10

图2  大鼠卵巢形态HE染色

2.3各组TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达情况

结果显示，与空白对照组比，Model组TLR4、MyD88和NF-κB p65在卵泡膜细胞、卵泡颗粒细胞中表达水平显著升高，而EGCG和二甲双胍治疗组TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达水平与Model组相比显著降低，如图3所示。

图3  卵巢组织TLR4、MyD88和NF-κB p65免疫组化染色图（X 10）

2.4EGCG对NF-κB p65核转位的影响

NF-κB p65从细胞质进入细胞核可诱导多种炎症因子释放。IF结果显示，与空白对照组比较，Model组NF-κB p65 入核增多，而EGCG和二甲双胍治疗组NF-κB p65主要定位在细胞质中（图4）。

绿色荧光标记为NF-κB p65蛋白，蓝色荧光（DAPI）标记为细胞核

图4 EGCG对NF-κB p65核转位的影响（X10）

3 讨  论

PCOS被认为是一种低度的慢性炎症性疾病，炎症与免疫密切相关，Toll样受体家族是先天免疫的重要组成部分。TLR4是Toll样受体家族的重要成员之一，通过与髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）结合，完成信号转导。TLR4/MyD88进一步激活NF-κB p65并促进炎性细胞因子基因转录[13]。NF-κB是参与炎症反应的主要信号转录因子。非炎症状态时，NF-κB p65与其抑制分子IκB在细胞质中结合形成复合物。一旦被上游信号分子激活，IκB磷酸化和降解，进一步激活NF-κB p65，使其从复合物中释放并转移至细胞核。入核的NF-κB p65激活下游一系列信号分子，包括促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α等，引起炎症反应。现代药理学研究表明， EGCG不仅对肿瘤有明显的抑制作用，而且由于其抗氧化和抗炎的生物学特性，对代谢性疾病也有治疗作用。有研究表明，EGCG课通过降低TLR4-NOX3/4-ROS水平并通过TLR4-NF-κB通路抑制神经炎症，导致促炎细胞因子的抑制，恢复了海马神经发生[14]。You等人报道，EGCG促进复发性阿弗他溃疡小鼠口腔溃疡的愈合，并增加溃疡皮肤组织中胶原纤维的体积分数，该机制可能与降低TNF-γ和IL-6表达水平以及抑制TLR4/MyD88/NF-βB信号通路有关。总之，越来越多的研究表明EGCG具有有效的抗炎作用。

本研究中，我们通过连续皮下注射DHEA成功建立了PCOS大鼠模型。PCOS大鼠表现出与PCOS妇女相似的内分泌特征，包括动情周期不规则、无排卵、卵巢结构紊乱以及内分泌水平异常等。我们通过给PCOS大鼠EGCG灌胃治疗，部分大鼠恢复了规则的发情周期，改善了卵巢囊泡样结构，卵巢重量下降，颗粒细胞层数量增多，细胞排列较规则，TLR4/MyD88/NF-κB p65蛋白表达降低，NF-κB p65蛋白入核被抑制。综上所述，我们的研究结果表明EGCG改善了PCOS大鼠卵巢炎症微环境，为EGCG应用于临床治疗PCOS提供了参考依据。

  参 考 文 献

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项目名称：儋州市科学技术和工业信息化局科研项目

项目编号：25WS005