高效液相色谱-串联质谱法同时测定多种水果中21种植物生长调节剂

摘要：植物生长调节剂(PGRs)通常是合成的化合物，其结构和生理功能与天然和内源性植物激素相似。它们可能在增强植物抗逆性、促进植物细胞分裂和生长以及提高植物产量和质量方面发挥关键作用。因此，它们已广泛应用于农业生产中。但是，在缺乏监督的情况下过度使用这些PGRs，可能导致蔬菜和水果中PGRs残留量升高，从而可能威胁公共健康。目前，许多国家和国际组织已制定相关法规，规定了各种水果中某些PGRs的最大允许残留限量(MRL)。欧盟已规定大多数新鲜水果中丁酰肼、噻苯隆和抑芽唑的MRL分别为0.02、0.01和0.01mg/kg。日本将西瓜中抗倒酯的MRL限制为0.02 mg/kg；中国将葡萄中氯吡脲的MRL限制为0.05mg/kg，将某些水果（如苹果和梨）中2,4-D的MRL限制为0.01mg/kg。因此，开发一种高灵敏方法来监测相关农产品中的这些PGRs残留至关重要。

关键词：高效液相色谱；串联质谱法；植物生长调节剂

由于PGRs种类很多，化学结构差异巨大。这使得同时分析多类PGRs面临非常大的挑战。在日常检验工作中，结合现有设备，将QuEChERS提取净化方法与HPLC-MS/MS技术结合起来，用来同时测定多种水果中的常用PGRs。

首先用含1%乙酸的乙腈对样品进行萃取，然后在硫酸镁的存在下使用C18吸附剂进行净化。使用ESI-三重四极杆质谱仪在多反应监测(MRM)模式下进行检测。采用基质匹配外标校准方法进行定量分析。对于检测的苹果、梨、草莓、葡萄和橙子基质，所有21种化合物均表现出0.10–1000µg/L范围内2–3个数量级的动态线性范围，相关系数高于0.99。该方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别在0.020µg/kg–6.0µg/kg和0.10µg/kg15.0µg/kg之间。对于所有化合物，平均加标回收率在73.0%–111.0%的范围内，且相对标准偏差（RSD，n=6）在3.0%–17.2%的范围内。该方法快速、简单、有效、灵敏且准确，符合对水果中这些植物生长调节剂的测定要求。

一、实验部分：

21种植物生长调节剂(PGRs)包括丁酰肼、矮壮素、助壮素、氯化胆碱、2,4,5-三碘苯甲酸、赤霉酸、环丙酰草胺、脱落酸(ABA)、氯吡脲、6-苄氨基嘌呤、噻苯隆、2,4-D、调果酸、4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、1-萘乙酸、吲哚-3-乙酸(IAA)、抗倒胺、多效唑、烯效唑、抑芽唑和抗倒酯，它们全部购自Dr.Ehrensterfer（德国），纯度高于96%。

用甲醇（HPLC级）配制浓度为100.0mg/L的标准溶液，并将其保存在4℃下。使用初始流动相或基质提取物将储备液进一步稀释至一系列浓度，用于外标定量。

二、样品前处理：

准确称取10g样品，加入50mL离心管中。然后加入10mL酸化乙腈（1% 乙酸的乙腈溶液）。将混合物均质化2分钟。将4gMgSO4和1.5g乙酸钠加入样品瓶中。然后将其涡旋混合1分钟，再以4000rpm离心3分钟。将2mL上清液样品溶液装入洁净的2mL样品瓶中，该样品瓶中含25mgC18吸附剂和150mg无水MgSO4。将样品瓶涡旋混合1分钟，然后以16000rpm离心5分钟。使上清液通过0.22µm膜的过滤，储存在4℃下，待LC-MS/MS分析。

三、仪器条件：

1.色谱柱：Agilent XDB-C18，4.6×100 mm，5.0um

2.柱温：35℃

3.进样量：5µL

4.进样针清洗：冲洗口(100%甲醇)，5秒

5.流动相：A）5mmol/L乙酸铵/0.05%甲酸水溶液

B）乙腈

6.梯度流速：0.5mL/min

7.梯度洗脱曲线

质谱配置和条件

1.配备安捷伦喷射流离子源的Agilent 6460 三重四极杆质谱仪

2.电离模式：正/负离子模式

3.扫描模式：多反应监测(MRM)

4.毛细管电压：4000V

5.喷嘴电压：500V

6.雾化气压力：45 psi

7.干燥气温度：300℃

8.干燥气流速：10L/min

9.鞘气温度：375℃

10.鞘气流速：11 L/min

四、结果与讨论：

液相色谱条件的选择

最初使用窄径细颗粒柱分离21种PGRs。但是，由于21种PGRs的极性差异很大，因此极性极强的化合物（如丁酰肼、矮壮素、助壮素和氯化胆碱）会在2分钟内从色谱柱中洗脱，且ESI-MS/MS检测期间的共流出干扰物质对这些目标物响应抑制非常严重。使用常规色谱柱Agilent XDB-C18 (4.6 × 150 mm, 5 µm) 后发现，所有化合物的保留时间均长于2.5分钟，基质的共流出干扰有一定程度的降低。因此，选择Agilent XDB-C18 色谱柱来分离目标化合物。

最初选择由乙腈/水组成的二元流动相。为获得更出色的分离和检测灵敏度，通常将甲酸、乙酸铵或甲酸与乙酸铵的混合物加入水相中，来调节分离选择性和灵敏度。对三种类型的流动相组成进行比较，结果发现，浓度分别为5 mmol/L 乙酸铵和0.05% 甲酸混合溶液表现出了最出色的峰分离度和峰形，因此选择混合添加剂水溶液作为水相。

五、QuEChERS 提取和净化步骤的优化：

应用QuEChERS 方案进行样品提取和净化。为更好地从水果基质中提取目标分析物，对乙腈、乙腈/1% 乙酸、乙腈/2% 乙酸和乙腈/1% NaOH 进行了比较。使用乙腈/1% 乙酸时，苹果基质中所有21 种PGRs的加标回收率可达到80% 或更高。因此，选择乙腈/1%乙酸作为提取溶剂。

为进一步净化，对使用经典吸附剂（例如在 MgSO4 存在下，PSA、C18、GCB 或三者组合）的分散式固相萃取(dSPE) 进行了考察。使用PSA 作为净化吸附剂，仅五种化合物（包括氯吡脲、抗倒胺、多效唑、烯效唑和抑芽唑）的回收率高于70%，而所有其他化合物的回收率均低于40%。将PSA 与C18 或GCB 结合使用，未表现出任何改善。相比之下，在 MgSO4 存在下使用C18 作为净化吸附剂，可有效回收21 种分析物，其回收率均高于75%。因此，选择C18 进行净化。

六、方法性能

在LC/MS 分析过程中，基质干扰不可忽略，它可能增强或抑制目标分析物的响应，从而降低定量分析准确度。为提高分析准确度，必须对基质干扰进行评估，且必须采用适当策略最大程度减小基质效应。在本研究中，我们使用相对响应来评估基质效应（基质效应ME% = 基质中的峰面积/纯溶剂中的峰面积× 100%，其中当ME% >100% 时存在基质增强效应，而在ME% < 100% 时存在基质抑制效应）。48% 的化合物表明ME%超过大多数监管机构规定的可接受范围(80%–120%)。特别是在苹果和橙子基质中，分别有约三分之一的化合物表现出基质增强和抑制效应。这表明在分析过程中不能忽略该基质效应。

七、准确度和精密度

为进一步评估该方法的准确度和精密度，对包括苹果、梨、草莓、葡萄和橙子在内的各种样品进行检测。选择未检测到目标分析物的样品作为空白基质。将三种浓度的各种分析物加入空白基质中，重复分析六次，然后对加标样品进行提取和净化，然后进行LC-MS/MS分析。五种空白基质中21 种分析物的添加回收率均在73.0%–111.0% 的范围内，且相对标准偏差(RSD) 在 3.0%–17.2% 的范围内，满足残留分析关于准确度和精密度的要求。

通过对多种水果中21种植物生长调节剂系统研究，经过实验证明，运用QuEChERS 提取和净化方法，并对苹果、梨、草莓、葡萄和橙子中调节剂进行比对，准确度及精密度均在范围内，对水果中21种植物生长调节剂有了科学的数据研究及检验方法论证。

八、结束语

本研究成功建立了一种基于 QuEChERS 提取净化结合 LC-MS/MS 技术的分析方法，实现了对苹果、梨、草莓、葡萄和橙子等多种常见水果中 21 种植物生长调节剂的同时快速检测。该方法通过对提取溶剂、净化吸附剂、色谱柱及流动相组成等关键条件的优化，有效解决了不同极性植物生长调节剂同步分离检测的难题，兼具灵敏、准确、高效的优点，检出限与定量限均能满足国内外相关法规对水果中植物生长调节剂残留限量的检测要求。

在农业生产现代化进程中，植物生长调节剂的合理应用是提升水果产量与品质的重要手段，但残留超标问题始终威胁着食品安全与公众健康。本研究建立的检测方法，可为农产品质量安全监管部门提供可靠的技术支撑，助力实现对水果生产全链条的精准把控，从源头降低不合格产品流入市场的风险。与此同时，本研究也存在一定的局限性。实验仅针对五种常见水果基质展开验证，对于浆果类、核果类等其他类型水果基质的适用性仍需进一步探索；21种目标物虽涵盖了常用品种，但仍无法覆盖农业生产中所有应用的植物生长调节剂类型。未来可进一步拓展研究范围，纳入更多水果基质与植物生长调节剂品种，优化方法以降低基质效应的影响，提升检测的普适性与准确性。此外，随着检测技术的不断革新，可结合高通量筛选技术、便携式质谱检测设备等前沿手段，推动水果中植物生长调节剂检测向现场快速检测、实时监测方向发展，为食品安全监管提供更加高效、便捷的技术方案，守护消费者的饮食安全与身体健康。相信在技术持续创新与监管不断完善的双重驱动下，农产品质量安全水平将得到稳步提升，为农业高质量发展与民生福祉保障贡献更大力量。