液相色谱-质谱联用法（LC-MS）测定阿普米司特中基因毒性杂质的含量

摘要：目的：采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）建立阿普米司特中基因毒性杂质硝基阿普米司特（杂质A）的定量分析方法，并对方法进行全面验证后，用于样品的质量控制。方法：采用LC-MS法，采用C18柱，采用5mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈为流动相，进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，进样量 10 μL。采用ESI源，正离子模式，SIM模式下选择m/z 449进行杂质A的定量。结果：杂质A在限度的20%～200%范围内线性关系良好，相关系数r≥0.99，检测限为0.0249μg /ml，杂质A回收率在99%～106%范围内，重复性和中间精密度的RSD均小于10%，供试品溶液在40小时内稳定。结论：所建立的检测方法，专属性好、灵敏度高、重现性及准确度良好，为阿普米司特中基因毒性杂质的质量控制，提供了可靠的数据支持。

关键词：液相串联质谱法；阿普米司特；基因毒性杂质；质量控制。

Determination of genotoxic impurities in Apomilast by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)

Abstract：bstract: Objective: To establish A method for the quantitative analysis of the genotoxic impurity nitroalpramilast (Impurity A) in Alpramilast by liquid chromatograph-mass spectrometry (LC-MS), and to verify the method comprehensively for sample quality control. Methods: Gradient elution was performed with 5mmol/L ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile as mobile phase using C18 column by LC-MS method. The flow rate was 1.0ml/min and the sample size was 10 μL. Impurity A was quantified using ESI source, positive ion mode and m/ z449 in SIM mode. Results: The linear relationship of impurity A was good in the range of 20% ~ 200%, the correlation coefficient r≥0.99, the detection limit was 0.0249μg /ml, the recovery rate of impurity A was in the range of 99% ~ 106%, the RSD of repeatability and intermediate precision were less than 10%, and the test solution was stable within 40 hours. Conclusion: The established detection method has good specificity, high sensitivity, good reproducibility and good accuracy, and provides reliable data support for the quality control of genotoxic impurities in apromikast..

Keywords： liquid phase tandem mass spectrometry; Alpromikast; Genotoxic impurities; Quality control.

阿普米司特是由Celgene公司开发的一种口服小分子磷酸二酯酶4（PDE4）抑制剂，PDE4抑制剂通过调节银屑病相关发病基因和炎症细胞的免疫应答以及细胞因子的表达，发挥抗银屑病的作用[1]。于2014年9月获得美国FDA 批准上市，商品名为Otezla®，用于治疗有活动性银屑病关节炎的成年患者。2021年12月美国FDA追加批准其用于治疗轻中重斑块状银屑病，该药是FDA批准的首个也是唯一用于斑块型银屑病的PDE4抑制剂。2021年8月我国批准其用于治疗轻中重斑块状银屑病。阿普米司特化学名为（S）-2-[1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-甲磺酰基乙基]-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1,3-二酮[1-3]，在其合成中，物料残留物3-硝基邻苯二甲酸与中间体4反应生成硝基阿普米司特（杂质A），因该步反应生产粗品，精制后即是成品，故该杂质极易残留至成品中。杂质A和阿普米司特的结构信息见表1。

表1 杂质A和阿普米司特的结构信息

杂质A的生成路径见图1

图1 杂质A的生成路径

阿普米司特中基因毒性杂质A为芳香硝基类杂质，世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单中亦有多个芳香硝基类物质，且对其进行Derek和Sarah软件预测其结构为阳性，故需对其进行严格。考虑到阿普米司特的制剂用于银屑病的治疗，每日最大服药剂量为60mg，需要长期或反复用药；故参考ICHM7中治疗时长大于10年的阈值，可允许摄入量1.05μg/天，计算得到阿普米司特中的杂质A的量不能超过25ppm；按此限度严格控制，从而确保患者用药的安全性[4-7]。本文为此开发了LC-MS法，满足低限度下基因毒性杂质的检测要求，且能保证高灵敏度及结果准确的要求。

1仪器与材料

1.1仪器

百万分之一天平，梅特勒，XP6；液质联用仪（LC-MS），岛津，LCMS-8040；

材料

试药：阿普米司特（江苏正大清江制药有限公司，批号：20220918、20220924、20220926，规格：原料药）；杂质A（江苏正大清江制药有限公司，批号：20220612，纯度：96.09%）

试剂：乙腈（色谱纯，批号：A22T0103；ASTOON）乙酸铵（分析纯，批号：191021；西陇科学股份有限公司） 

2方法和结果

2.1 方法

2.1.1 LC-MS仪器参数及色谱条件

采用单四级杆质谱检测器；离子源为ESI，加热块温度为400℃；DL温度为250℃；SIM模式下选择m/z 449进行杂质A的定量；载气为氮气，雾化气流量为每分钟3L，干燥气流量为每分钟5L。

采用C18色谱柱（250mmÍ4.6，5μm）；以5mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈为流动相；按表2进行洗脱；流速为每分钟1.0ml；质谱采集时间为20～25min；进样量10μl。

表2 梯度洗脱程序

2.1.2 溶液的配制

（1）稀释剂：乙腈，空白溶液。

（2）对照品贮备液：取杂质A适量，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含25μg杂质A的溶液。

（3）对照品溶液：精密移取对照品贮备液适量，用稀释剂稀释制成每1ml中约含0.25μg杂质A的溶液。

（4）供试品溶液：取供试品适量，精密称定，加稀释剂使溶解并稀释制成每1ml中约含0.01g阿普米司特的溶液。

（5）供试品加标溶液：取供试品适量，精密称定，加稀释剂溶解后，加对照品贮备液适量，再加稀释剂稀释制成每1ml中约含0.01g阿普米司特，约含0.25μg杂质A的溶液

2.1.3 专属性试验

分别取2.1.2项下稀释剂、对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液，分别注入仪器中，记录色谱图。

2.1.4 检测限与定量限

检测限溶液（10%）：精密量取对照品溶液1.0ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释后定容，摇匀，即可。配制1份；

定量限溶液（20%）：精密量取对照品溶液2.0ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释后定容，摇匀，即可。平行配制6份。

检测限溶液分析3次、6份定量限溶液各分析1次，记录色谱图。

2.1.5 线性与范围

取2.1.2项下对照品贮备液，按表3分别移取不同的体积，用稀释剂分别定容成相应浓度。取各水平溶液，按2.1.1项下色谱条件测定，以杂质A浓度为横坐标，各对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。

表3 杂质A各线性配制方法

2.1.6 准确度

照2.1.2项下供试品加标溶液，同法配制3个浓度水平（20%、100%、150%）的加标溶液，每个浓度平行配制3份。取供试品溶液、加标供试品溶液按2.1.1项下色谱条件测定，记录色谱图，按下式进行回收率计算。

回收率计算公式：

2.1.7重复性

照2.1.2项下供试品加标溶液，同法平行配制6份，按2.1.1项下色谱条件测定，记录色谱图，按回收率公式进行计算。

2.1.8中间精密度

不同试验人员在不同的试验日期，采用不同的色谱柱，重复2.1.7项下试验。

2.1.9 溶液稳定性

照2.1.2项下对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液，室温放置，分别于不同时间点取样检测，考察对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液在室温条件下的稳定性。

2.1.10 耐用性

考察在色谱条件有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据，对对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液进行分析，考察系统适用性和回收率是否符合要求，各耐用性色谱条件见下表4。

表4：耐用性色谱条件

2.1.11 样品检测

照2.1.2项下供试品配制方式，配制其他不同批次供试品溶液（批号： 180701、180702），分别配制2份，分别注入仪器中，记录色谱图，按外标法计算杂质A的含量。

2.2 结果

2.2.1 专属性

稀释剂对杂质A的测定无干扰；对照品溶液中，杂质A峰与相邻峰之间的分离度应符合要求；供试品加标溶液中，杂质A峰与相邻峰之间的分离度应符合要求，杂质A峰的保留时间与对照品溶液中杂质A峰的保留时间一致。稀释剂与供试品加标溶液见图2

图2 稀释剂与供试品加标溶液

2.2.2检测限与定量限

检测限溶液色谱图中，杂质A峰的信噪比为4.0～6.0（＞3），符合可接受标准。6份定量限溶液色谱图中，杂质A峰的信噪比为10.1～12.8（＞10），峰面积的RSD值为3.1%（＜8.0%），符合可接受标准。表明本方法杂质A检测限浓度为0.0249μg/ml，即2.49ppm；杂质A定量限浓度为0.0498μg /ml，即4.98ppm。

2.2.3线性与范围

杂质A的线性方程、相关系数、线性浓度范围结果见表5及图3，杂质A在20%～200%限度范围内线性关系良好，相关系数r≥0.99，线性关系良好。

表5 杂质A线性与范围结果

图3 杂质A线性图

2.2.4 准确度

准确度试验结果见表6，分别在20%、100%、150%浓度下进行加样回收试验，准确度均在99%～106%范围内，回收率的RSD均小于6.0，表明准确度良好。

表6 准确度试验结果

2.2.5 重复性与中间精密度

6份重复性溶液中，杂质A的回收率为101.5%～106.1%，回收率的RSD值为1.7%。符合可接受标准，表明本方法重复性良好；6份中间精密度溶液中，杂质A的回收率为99.6%～103.9%，回收率的RSD值为1.7%。两名试验人员所得12份供试品加标溶液中杂质A回收率的RSD值为2.1%（＜8.0%）。表明本方法精密度良好。

2.2.6 溶液稳定性

对照品溶液在室温放置44小时内，各时间点杂质A峰面积的比值为88.1%～99.0%（在85%～110%之间）；供试品溶液在室温放置40小时内，各时间点杂质A峰面积均为0；供试品加标溶液在室温放置41小时内，各时间点杂质A峰面积的比值为87.1%～94.3%（在85%～110%之间）；表明对照品溶液在室温放置44小时内稳定；供试品溶液在室温放置40小时内稳定，不会降解产生杂质A；供试品加标溶液在室温放置41小时内稳定。

2.2.7 耐用性

本方法的色谱条件：流速（1.0±0.05ml/min）、流动相初始比例（A:B）（96:4/94:6），在微小变动的情况下，5针对照品溶液1色谱图中，杂质A峰面积RSD值为0.6%～2.5%（＜4.0%），保留时间的RSD值为0.1%～0.4%（＜1.0%），7针对照品溶液杂质Af值的RSD值为0.8%～2.4%（＜4.0%），各耐用性条件下系统适用性均符合要求。杂质A的回收率为97.8%～101.9%（在85%～110%之间），各耐用性条件下回收率的RSD值为1.8%（＜8.0%）。均符合可接受标准，表明本方法的耐用性良好。

2.2.8 供试品测定

采用上述经过各项验证后的检测方法，对三批阿普米司特，进行杂质A检测，三批杂质A检出量均小于检测限（2.49ppm）。

3 讨论

杂质A在LC–MS中，离子源为ESI，正模式下，产生m/z为449和m/z为466的峰，分别为[M+H+]和[M+NH4+]峰，采用[M+H+]的449峰建立定量检测方法，并参照2020年版中国药典四部通则9101分析方法验证指导原则下要求，进行各项验证，结果表明该方法专属性良好，成线性关系，回收率和重复性都符合要求，且方法在一定范围内耐用性良好，该方法可以准确评估阿普米司特中基因毒性杂质A情况[8]。

杂质A于合成末端产生，残留于成品中的可能性较大；采用LC–MS对其建立了高灵敏度、高准确度的检测方法，且按照最严限度进行控制，对每一批样品进行检测后放行，对于该品种来说，提高了其安全性，并有效保障了药品的质量可控性。

参考文献

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[2]江金凤,仲奥,王肖肖,周玉洁,.高效液相色谱法测定阿普斯特对映异构体[J].广东化工,2020,47(7)

[3]杨敏,闫翠勤,徐艳梅,郝丽娟,王春霞,.气相色谱法检测阿普米司特原料药中有机溶剂残留[J].中国药业,2024,33(1)

[4]李开凤,普俊学,高宏涛,.HPLC法测定盐酸法舒地尔中基因毒性杂质[J].海峡药学,2018,30(2)

[5]石小娜[1,2],张志英,王立爽,赵龙山,.LC-MS/MS法测定盐酸法舒地尔中2种基因毒性杂质的含量[J].中国新药杂志,2021,30(13)

[6]徐甲,刘鑫,卢文君,黄伟勤,.气相色谱法测定利格列汀中基因毒杂质氯乙腈[J].中国医药工业杂志,2021,52(9)

[7] ICH.GuidelineforElementalImpuritiesM7(R2)[EB/OL].(2019-03-22)

[8] 张勇，郑枫，周志慧. LC-MS /MS 法测定塞来昔布中对磺酰胺基苯肼的残留量 [J].中国药师，2019，22（3）：582-585.

第一作者简介：周志慧（1988-），本科学历硕士学位，工程师、执业药师，药物研发分析专业

通讯作者：谢福佳（1988-），硕士，工程师、执业药师，药物研发合成、分析专业