呼吸系统感染性疾病快速诊断技术的应用研究进展

摘要：呼吸道传染病已成为严重威胁人类健康的重大公共健康问题。常规的细菌培养等方法存在灵敏度低、时间长等缺点，不能满足临床快速检测的要求。近年来，分子生物学及纳米科技的飞速发展，为疾病的早期诊断提供了新的思路。快速诊断技术为临床提供快速准确的呼吸道常见感染性疾病病因诊断依据 ，以便尽快诊断、预防传播、正确治疗 ，协助临床排除重急性呼吸综合征及禽流感诊断。本文对呼吸系统感染性疾病快速诊断技术进行了分析，并对其应用价值与未来展望进行了探讨。以期为促进快速诊断技术的推广应用提供依据。

关键词：呼吸系统感染；快速诊断技术；应用研究

上呼吸道感染、肺炎等都是由细菌、病毒、非典型病原体等引起的呼吸系统感染性疾病。传统的病原体检测方法多采用微生物培养及血清学检测等手段，但因其灵敏度低，难以实现对该病原的早期准确诊断。近年来，非典型肺炎、甲型H1N1流感等新发突发传染病的爆发，迫切需要对呼吸道传染病的快速检测。对其进行快速、准确的病因诊断，对于指导临床合理用药、有效地控制感染扩散具有重要意义。近年来，分子生物学及生物传感等技术的飞速发展，使呼吸道传染病的快速检测成为可能。因此，探讨呼吸系统感染性疾病快速诊断技术的应用研究进展具有重要意义。

1.呼吸系统感染性疾病快速诊断技术

1.1分子诊断技术

1.1.1 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术

PCR技术以其高灵敏、高特异的特点，已经成为当前呼吸系统疾病诊断的核心技术。实时荧光定量 PCR （Quantitative Real-time polymerase chain reaction，qPCR）技术可在活体水平上对病原核酸进行准确定量，并可将检测时间缩短到2小时内。这一技术上的突破已被 WHO确定为国际上公认的“金标准”。数字 PCR （dPCR）是一种新兴的快速检测方法，其可以将反应系统分成数万个独立反应单元，不需要用标准曲线就能进行快速、准确的测定，在低病毒含量样品检测与耐药基因突变分析方面具有独特优势。采用多重PCR技术，通过对引物的设计及反应系统的优化，可以同时进行多个呼吸道病原菌的鉴定[1]。如FilmArray系统对巢式PCR和熔解曲线分析技术进行了整合，实现对20多种病原菌在1小时之内进行快速、准确的检测，为实现混合感染的精确诊断奠定基础。但目前该方法还存在着引物易产生二聚、扩增效率参差不齐的技术瓶颈，需结合人工智能辅助引物设计及新的聚合酶链反应优化等方法来提高检测效率。

1.1.2等温扩增技术

等温扩增技术由于不需要使用热循环仪等特点，在基层医学领域具有明显的优势。环介导等温扩增 (loop mediated temperature repeat, LAMP）是一种以4-6条特异性引物与Bst DNA聚合酶，在60-65℃等温下对目标序列进行高效率扩增。临床研究显示，该方法敏感性与特异度较高，对样品提纯要求更低，尤其适用于医疗资源缺乏的地区[2]。重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术是一种将酶-单链结合蛋白复合体与引物相结合的方法，可以在37-42℃温和环境下实现对核酸分子的扩增。将其用于 SARS冠状病毒的快速检测，结果表明，其对样品的耐受性明显优于常规 PCR，且检测时间不超过20分钟，是实现现场快速检测的理想方法[3]。

1.1.3基因测序技术

下一代DNA测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）因其不需要预先确定目标而在新病原体识别及复杂疾病的诊断等方面具有重要意义。宏基因组二代测序(Metagenomics Next Generation Sequencing，mNGS）是一种可以同时检测细菌、病毒、真菌和寄生虫的新技术。大量研究表明， mNGS阳性率比常规检测方法高，并且平均检测时间缩短到24 h[4]。但是，目前这一方法仍然存在操作流程烦琐，对生物信息分析的专业性要求较高及检测成本较高的问题。基于纳米孔测序技术的发展为上述问题提供全新的思路，其仪器微型化和实时测序等优势使得其在突发事件的快速溯源方面显示出其独特的应用价值[5]。

1.2免疫学检测技术

1.2.1免疫层析技术

侧流免疫层析（(lateral flow immunochromatography assay，LFIA）因其操作简单、快速、经济等优点，已经成为快速、简便的现场快速检测方法。在新冠肺炎疫情的防控过程中，抗原试纸在社区筛查、早诊断等方面具有重要意义，可以有效减轻实验室检验的压力。但是，常规胶体金标记方法由于灵敏度的限制，对低含量样品的检测存在一定的假阴性。为解决这一问题，研究者研发了许多新型信号放大方法[6]。量子点标记技术根据其独特的光学特性，可以提升检测灵敏度，时间分辨荧光免疫层析技术通过长寿命荧光特性，可以使背景干扰有效消除，可以实现 pg/mL水平的高灵敏检测[7]。

1.2.2化学发光免疫分析

化学发光免疫分析（Chemiluminescence analysis,CLIA）是一种集免疫识别和高灵敏检测于一体的新型检测方法。相对于常规 ELISA方法， CLIA具有6个量级以上的线性范围、更高的检测灵敏度，可对病原抗原、抗体进行准确定量。基于 CLIA技术的电化学发光免疫分析（Electrochemiluminescence Immunoassay，ECLIA），利用外加电场对钌配合物的电致化学发光过程进行精准调控，实现 fg/mL量级的检测。ECLIA是一种快速、灵敏、特异度高的新型免疫分析技术，用于呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）抗原检测，具有很好的应用前景。

1.3新型生物传感技术

1.3.1电化学生物传感器

电化学生物传感器能将生物分子的识别信号转换成电信号，从而达到快速、高灵敏检测的目的。核酸适配体传感器以前期筛选得到的核酸适配体为识别单元，与电化学分析技术相结合，在呼吸道感染性疾病如肺结核、流感等疾病的早期诊断中显示了良好的应用前景。核酸抗体作为一种新型的抗体，在生物医学领域有着广泛的应用前景。场效应晶体管（Field Effect Transistor，FET)生物传感器已成为当前研究热点，石墨烯的FET传感器在 SARS冠状病毒的检测中达到1 fg/mL，不需要采集、放大等操作，只需几分钟即可完成[8]。

1.3.2 光学生物传感器

表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）传感器可通过检测与生物分子的相互作用而导致折射率的改变，从而达到免标记、定量检测病原体抗原和抗体的目的。基于局域表面等离子体共振(LocalizedSurfacePlasmonResonance，LSPR）是一种全新的研究思路，其可以通过对金属微纳结构进行光学性质的调控，从而提高检测的灵敏度，并大大简化仪器的设计。光纤生物传感器以光纤为媒介，通过探测生物与生物体的相互作用而产生的倏逝场或荧光信号，可以实现对病原菌的高灵敏探测。该类传感器具备良好的抗干扰能力，适合远程监控及多参数监测，对 ICU医院感染的实时监控具有重要意义。

2. 呼吸系统感染性疾病快速诊断技术的临床应用价值

2.1指导精准抗感染治疗

快速诊断技术能对病原体进行准确的鉴别，彻底改变传统的以经验为主的抗感染治疗方式。通过建立的基于分子诊断技术的抗生素给药方案，可以将细菌病原诊断时间由72 h压缩到24 h以内，极大地缩短重症感染性疾病的治疗时间。快速检测可为临床早期针对性治疗，既能提高患者的生存率，又能有效抑制广谱抗生素的滥用。在耐药监控方面， GeneXpert MTB/RIF技术可以实现对利福平和结核病的快速、准确、快速、准确的诊断，为结核病的预防和治疗提供重要的科学依据。通过本项目的实施，将为碳青霉烯类药物的研发提供新的思路和方法，为临床提供新的思路和方法。本项目的实施，既能体现个性化诊疗的“精准医疗”理念，又能从宏观上推动抗生素合理用药，对于延缓细菌耐药的发生，具有重要的现实意义。

2.2医院感染控制

快速诊断技术是医院感染防控的关键技术。通过对住院患者进行全身呼吸道病原体的快速筛查，可以对无症状感染者和潜伏期患者进行及时发现，达到对感染病例的早期隔离和管理。研究表明，对呼吸科病房进行系统性的呼吸道病毒筛查，可以使院内呼吸道感染的传染率下降[9]。在流感高发季节，对医护人员进行常规、快速的筛查和干预，既能减少医护人员被传染的危险，又能保证医护团队在疫情高峰时期的稳定，保障医疗体系的正常运转。基于多学科交叉融合的新型检测方法，可以实现对院内感染的精确定位，从而达到最优防控效果，减少医疗资源的浪费。在 ICU等高危地区，通过构建快速检测系统，对耐药菌的扩散情况进行实时监测，为医院感染的及时防控提供科学依据。以快速诊断为核心的积极预防和治疗方式，已逐渐替代了传统的“被动反应”，成为医院感染管理系统的一个重要组成部分。

2.3公共卫生防控

快速诊断技术对于我国重大公共卫生事件的突发事件及疫情的常态化防控具有重要的战略意义。针对新型呼吸道传染病的暴发流行，快速检测可为构建早期预警防线、实现精确隔离、阻断传播链提供重要的技术支持。在新冠肺炎的防控实践中，将抗原检测和核酸检测相结合的方法，不仅能满足大样本筛查的时间需求，还能保障重点病例的诊断精度，形成分级的检测策略。该系统可大幅提高我国公共卫生突发事件的应对能力，将基本再生数（R0）降至0.3-0.5。在季节性呼吸系统疾病的预防和控制中，通过推广和推广快速检测技术，优化医疗资源分配，实现患者分流，缓解疫情季节医院的诊疗压力。还将构建新型的传染病监控系统，以实现对疾病的实时监测，并为疾病控制策略的制定提供依据。尤其是在资源匮乏的地方，利用便携式快速测试仪器，可以弥补实验室测试手段的不足，提升公众健康服务的可及性[10]。

结论

总之，近年来，呼吸系统感染性疾病的快速诊断技术得到广泛应用，极大地提升了病原体的检测效率与精度，为临床防治感染、预防和控制感染提供了重要的技术支撑。分子诊断、生物传感等技术各有特点，具有各自的特点，具有广泛的应用前景。在今后的研究中，随着技术的发展与融合，快速、灵敏、便捷的检测方法必将对疾病的个性化治疗与公共健康防控起到重要作用。但是，技术标准化、人员培训等方面还有待加强。

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