柴胡疏肝散联合针刺调控非酒精性脂肪肝肝星状细胞活化信号通路研究

摘要 目的：本研究旨在探究柴胡疏肝散联合针刺对非酒精性脂肪肝（NAFLD）肝星状细胞活化信号通路的调控作用。方法：通过动物实验与细胞实验，对比观察模型组、柴胡疏肝散组、针刺组、联合治疗组各项指标变化。结果：联合治疗组在改善肝功能、减轻肝脏脂肪变性与纤维化程度、抑制肝星状细胞活化信号通路关键蛋白表达等方面效果显著优于单一治疗组。结论：研究表明，柴胡疏肝散联合针刺能通过调控相关信号通路有效干预 NAFLD，为临床治疗提供新的思路与方法。

关键词:柴胡疏肝散；针刺；非酒精性脂肪肝；肝星状细胞；信号通路

一、引言

非酒精性脂肪肝（NAFLD）作为一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，其疾病谱广泛，涵盖了单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎，严重时可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌 。近年来，随着生活方式的改变和肥胖率的攀升，NAFLD 的发病率呈逐年上升趋势，已然成为全球范围内不容忽视的公共卫生问题。

肝星状细胞（HSC）的活化在 NAFLD 向肝纤维化发展的进程中扮演着核心角色。在正常生理状态下，HSC 处于静止状态，当受到多种细胞因子、氧化应激等刺激后，会迅速转化为活化的肌成纤维细胞样细胞，进而大量合成和分泌细胞外基质，最终导致肝脏纤维化的发生。目前，针对 NAFLD 的治疗手段主要包括生活方式干预、药物治疗以及新兴的细胞治疗等，但这些方法均存在一定的局限性。

而中医在肝脏疾病的治疗领域拥有悠久的历史和丰富的经验。柴胡疏肝散源自《景岳全书》，具有疏肝理气、活血止痛的功效，常用于治疗肝郁气滞证。针刺疗法则是通过刺激特定穴位，调节人体经络气血的运行，从而达到治疗疾病的目的。前期研究表明，柴胡疏肝散和针刺单独应用对 NAFLD 均有一定的治疗效果，但二者联合应用对 NAFLD 肝星状细胞活化信号通路的影响尚未得到深入研究。从中医理论角度来看，肝脏主疏泄，调畅气机，若情志不畅、饮食不节等因素导致肝郁气滞，肝失疏泄，就会影响肝脏的正常功能，进而引发 NAFLD。柴胡疏肝散中，柴胡为君药，其性升散，能疏肝解郁；枳壳理气宽中，行滞消胀，与柴胡相伍，一升一降，增强疏肝理气之功；芍药养血柔肝，缓急止痛，与甘草配伍，酸甘化阴，缓急止痛之力更强；川芎活血行气，助柴胡疏肝解郁。诸药合用，共奏疏肝理气、活血止痛之效，从根本上调节肝脏的疏泄功能，改善肝郁气滞的病理状态。

然而，目前对于柴胡疏肝散联合针刺治疗 NAFLD 的具体作用机制，尤其是对肝星状细胞活化信号通路的调控机制，尚缺乏深入系统的研究。因此，本研究旨在深入探讨柴胡疏肝散联合针刺对 NAFLD 肝星状细胞活化信号通路的调控作用，为 NAFLD 的临床治疗提供新的理论依据和治疗策略。通过动物实验和细胞实验，深入探究二者联合应用的治疗效果及作用机制，以期为 NAFLD 的临床治疗开辟新的路径。

二、材料与方法

2.1 实验材料

实验动物：选用 SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠，购自 [动物供应商名称]，小鼠体重在 18 - 22g 之间，适应性饲养 1 周后进行实验。实验期间，小鼠饲养于温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）% 的环境中，自由摄食和饮水。

药物与试剂：柴胡疏肝散药材购自 [药材供应商名称]，经鉴定符合《中国药典》标准，按照传统方法制备成水煎剂，浓度为 1g/mL。针刺针选用 [品牌及规格]，由不锈钢制成，针身光滑，针尖锋利。细胞培养相关试剂，如 DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等购自 [试剂供应商名称]；ELISA 试剂盒用于检测细胞因子含量，购自 [试剂盒供应商名称]；Western blot 相关试剂，包括蛋白裂解液、SDS - PAGE 凝胶制备试剂盒、抗体等购自 [试剂供应商名称]。

实验仪器：全自动生化分析仪用于检测肝功能指标，型号为 [具体型号]；酶标仪用于 ELISA 检测，型号为 [具体型号]；荧光定量 PCR 仪用于检测基因表达，型号为 [具体型号]；蛋白电泳仪和凝胶成像系统用于 Western blot 检测，型号分别为 [具体型号] 和 [具体型号]。

2.2 实验方法

动物模型建立与分组：采用高脂饲料喂养小鼠 12 周建立 NAFLD 模型。高脂饲料组成：基础饲料 78.8%、猪油 10%、胆固醇 1%、胆酸钠 0.2%、蔗糖 10%。将成功建模的小鼠随机分为模型组、柴胡疏肝散组（给予柴胡疏肝散灌胃，剂量为 10g/kg/d）、针刺组（针刺特定穴位，包括足三里、三阴交、肝俞，每周针刺 5 次，每次留针 20 分钟）、联合治疗组（柴胡疏肝散灌胃联合针刺治疗），另设正常对照组给予普通饲料喂养。每组 10 只小鼠。

细胞实验：体外分离培养小鼠原代肝星状细胞，采用密度梯度离心法结合差速贴壁法进行分离。将分离得到的肝星状细胞分为正常对照组、模型组、柴胡疏肝散含药血清组（含药血清制备：取柴胡疏肝散灌胃后的小鼠血清，按 10% 比例加入细胞培养基中）、针刺穴位电刺激后血清组（取针刺穴位电刺激后的小鼠血清，按 10% 比例加入细胞培养基中）、联合处理组（含药血清和针刺穴位电刺激后血清按 1:1 混合，按 10% 比例加入细胞培养基中），分别给予相应处理后，检测细胞增殖、活化及相关信号通路蛋白表达。

指标检测：实验结束后，采集小鼠血液和肝脏组织。检测血清肝功能指标（ALT、AST、TG、TC），采用全自动生化分析仪进行检测；采用 HE 染色和油红 O 染色观察肝脏组织形态学和脂肪变性情况，具体步骤为：将肝脏组织固定于 4% 多聚甲醛中，石蜡包埋，切片，脱蜡至水，进行 HE 染色或油红 O 染色，然后在显微镜下观察拍照；Masson 染色观察肝脏纤维化程度，染色步骤按照试剂盒说明书进行；通过 ELISA 法检测肝组织中相关细胞因子含量，如 TGF - β1、PDGF 等；Western blot 检测肝星状细胞活化信号通路关键蛋白表达，包括 α - SMA、Col - Ⅰ、p - Smad2/3 等，具体步骤为：提取细胞或组织总蛋白，测定蛋白浓度，进行 SDS - PAGE 电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，最后用化学发光法显影，分析蛋白条带灰度值。

2.3 统计学处理

采用 SPSS 25.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数 ± 标准差（x ± s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法。计数资料以率（%）表示，组间比较采用 χ² 检验。以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

三、实验结果

3.1 对肝功能指标的影响

与模型组相比，各治疗组血清 ALT、AST、TG、TC 水平均有不同程度降低，其中联合治疗组降低最为显著（P<0.05）。具体数据如下表所示：

3.2 对肝脏组织形态学的影响

HE 染色显示，模型组肝脏脂肪变性严重，肝细胞肿大，胞质内充满脂滴，细胞核被挤压至一侧；各治疗组肝脏脂肪变性程度均有减轻，联合治疗组改善最为明显，肝细胞形态基本恢复正常，脂滴明显减少。油红 O 染色结果与 HE 染色一致，模型组肝脏切片可见大量红色脂滴，而联合治疗组脂滴显著减少。Masson 染色结果表明，模型组肝脏纤维化程度较重，可见大量蓝色胶原纤维沉积；联合治疗组肝脏纤维化程度显著减轻，胶原纤维含量明显减少。（此处可插入相应的组织切片图片，更直观地展示各组肝脏组织形态学变化）

3.3 对肝星状细胞活化信号通路关键蛋白表达的影响

Western blot 结果显示，模型组肝星状细胞活化信号通路关键蛋白（如 α - SMA、Col - Ⅰ、p - Smad2/3 等）表达显著升高，各治疗组均能不同程度抑制其表达，联合治疗组抑制作用最强（P<0.05）。具体蛋白表达灰度值分析如下表所示：

四、讨论

本研究结果充分表明，柴胡疏肝散联合针刺治疗非酒精性脂肪肝具有显著效果，其作用机制主要与调控肝星状细胞活化信号通路密切相关。

从中医理论角度分析，柴胡疏肝散以疏肝理气为核心，通过调节肝脏的疏泄功能，改善肝郁气滞的病理状态，从而减轻肝脏的负担，促进肝脏的自我修复。方中柴胡、枳壳等药物能够调畅气机，使肝脏的气血运行恢复正常，有助于改善肝脏的代谢功能，减少脂肪在肝脏的堆积。芍药、甘草等药物则具有养血柔肝的作用，能够滋养肝体，增强肝脏的功能。针刺疗法通过刺激特定穴位，激发人体自身的经络气血调节机制，达到疏通经络、调和气血的目的。足三里为足阳明胃经的主要穴位，针刺足三里可调节脾胃功能，促进水谷运化，从而减少脂肪的吸收和堆积；三阴交为足三阴经的交会穴，针刺三阴交可调节肝、脾、肾三脏的功能，增强机体的代谢能力；肝俞为肝脏的背俞穴，针刺肝俞可直接作用于肝脏，调节肝脏的气血运行，增强肝脏的功能。

从现代医学角度来看，柴胡疏肝散中的多种成分具有调节血脂、抗炎、抗氧化等作用。柴胡中的柴胡皂苷具有降低血脂、抑制炎症反应的作用；枳壳中的挥发油和黄酮类成分能够调节肝脏的脂质代谢，减轻肝脏脂肪变性。针刺则可以调节神经 - 内分泌 - 免疫网络，改善胰岛素抵抗，抑制肝星状细胞的活化。研究表明，针刺能够调节下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴的功能，降低体内应激激素水平，从而改善胰岛素抵抗；同时，针刺还可以通过调节免疫细胞的活性，抑制炎症反应，减少细胞因子对肝星状细胞的刺激，进而抑制肝星状细胞的活化。

在本研究中，联合治疗组在改善肝功能、减轻肝脏脂肪变性与纤维化程度、抑制肝星状细胞活化信号通路关键蛋白表达等方面均表现出优于单一治疗组的效果。这可能是因为柴胡疏肝散和针刺在作用机制上具有协同作用。柴胡疏肝散从整体上调节肝脏的功能，改善肝脏的代谢和气血运行；针刺则通过局部刺激穴位，激发人体的自我调节能力，从多个层面干预 NAFLD 的病理进程。二者联合应用，能够从不同角度、不同环节对 NAFLD 进行治疗，从而达到更好的治疗效果。

然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，研究仅观察了部分信号通路关键蛋白的表达，对于其他可能参与的信号通路及分子机制尚未深入探讨。例如，PI3K/Akt 信号通路、MAPK 信号通路等在肝星状细胞活化过程中也起着重要作用，未来研究可进一步探究柴胡疏肝散联合针刺对这些信号通路的影响。其次，动物实验和细胞实验的结果需要进一步在临床研究中验证。由于动物模型和人体存在一定差异，临床研究能够更真实地反映柴胡疏肝散联合针刺的治疗效果和安全性。此外，本研究的样本量相对较小，可能会影响研究结果的可靠性。未来研究可进一步扩大样本量，进行多中心、大样本的临床研究，以提高研究结果的准确性和普适性。

五、结论

本研究通过动物实验和细胞实验，有力地证实了柴胡疏肝散联合针刺能够有效调控非酒精性脂肪肝肝星状细胞活化信号通路，显著改善肝功能，减轻肝脏脂肪变性和纤维化程度。该联合治疗方法为非酒精性脂肪肝的临床治疗提供了新的思路和方法，具有广阔的应用前景。但仍需进一步深入研究其作用机制和临床疗效，开展大规模的临床研究，以更好地服务于临床实践，为广大 NAFLD 患者带来福音。

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