m6A阅读蛋白YTHDC2与鼻咽癌顺铂耐药的关联研究

摘要：目的：探讨 m6A 阅读蛋白 YTHDC2 与鼻咽癌顺铂耐药之间的关联，为逆转鼻咽癌顺铂耐药提供新的潜在靶点。方法：选取 2020 年 1月至 2024 年 12 月我院收治的 30 例鼻咽癌患者作为研究对象，根据患者对顺铂治疗的反应分为顺铂敏感组（对照组，15 例）和顺铂耐药组（实验组，15 例）。采用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测两组患者癌组织中 YTHDC2 mRNA 的表达水平，采用 Western blot 检测两组患者癌组织中 YTHDC2 蛋白的表达水平。通过 CCK-8 法检测不同 YTHDC2 表达水平的鼻咽癌 CNE-2 细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50），流式细胞术检测顺铂处理后细胞凋亡率。结果：实验组患者癌组织中 YTHDC2 mRNA 及蛋白表达水平均显著高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。YTHDC2 高表达的 CNE-2 细胞顺铂 IC50 值 [（8.62±0.75）μmol/L] 显著高于 YTHDC2 低表达细胞 [（3.15±0.42）μmol/L]，差异具有统计学意义（P<0.05）。顺铂处理后，YTHDC2高表达 CNE-2 细胞凋亡率 [（12.35±1.56）%] 显著低于 YTHDC2 低表达细胞 [（28.67±2.34）%]，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：m6A 阅读蛋白 YTHDC2 在鼻咽癌顺铂耐药患者中高表达，其高表达可能通过降低细胞对顺铂的敏感性、抑制细胞凋亡从而促进鼻咽癌顺铂耐药的发生，YTHDC2 有望成为逆转鼻咽癌顺铂耐药的潜在分子靶点。

关键词：m6A 阅读蛋白；YTHDC2；鼻咽癌；顺铂耐药；细胞凋亡

一、资料与方法

1.1 一般资料

选取  2020 年 1月至 2024 年 12 月我院收治的 30 例鼻咽癌患者作为研究对象。所有患者均经病理检查确诊为鼻咽鳞状细胞癌，年龄 30~60 岁。根据患者接受顺铂化疗（顺铂 75mg/m²，每 3 周为 1 个周期，共 2~4 个周期）后的疗效评价结果，将患者分为顺铂敏感组（对照组）和顺铂耐药组（实验组），每组各 15 例。对照组中，男性 9 例，女性 6 例；年龄 32~58 岁，平均年龄（45.2±6.3）岁；临床分期：Ⅱ 期 5 例，Ⅲ 期 7 例，Ⅳ 期 3 例。实验组中，男性 10 例，女性 5 例；年龄 30~60 岁，平均年龄（46.5±5.8）岁；临床分期：Ⅱ 期 4 例，Ⅲ 期 8 例，Ⅳ 期 3 例。两组患者在性别、年龄、临床分期等一般资料方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有患者均签署知情同意书。

1.2 病例选择标准

本研究严格制定了纳入与排除标准以确保研究对象的同质性。纳入标准具体包括：①经病理组织学检查明确诊断为鼻咽部鳞状细胞癌的患者；②年龄范围限定在30周岁至60周岁之间；③既往未接受过放射治疗、靶向药物治疗或免疫治疗，且首次采用含顺铂方案进行化疗的患者；④临床病历资料完整，能够配合完成定期随访及相关实验室检测项目；⑤患者充分知情并自愿签署书面知情同意书。排除标准则包括：①合并存在其他原发性或转移性恶性肿瘤的患者；②合并严重心脏功能不全、肝功能衰竭或肾功能衰竭等重要脏器功能障碍的患者；③合并系统性自身免疫性疾病或活动性感染性疾病的患者；④处于妊娠期或哺乳期的女性患者；⑤既往有明确顺铂类药物过敏史的患者。

关于顺铂耐药的判定标准，本研究严格参照实体瘤疗效评价标准（RECIST 1.1版）执行。具体判定方法为：患者在接受含顺铂方案化疗2个完整周期后，若影像学评估显示肿瘤出现进展（定义为靶病灶最大径之和较基线增加≥20%，或出现新发病灶）；或完成4个周期化疗后病灶保持稳定但未获得明显临床获益者，均判定为顺铂耐药组。反之，若化疗后达到完全缓解（所有靶病灶消失）或部分缓解（靶病灶最大径之和缩小≥30%）者，则判定为顺铂敏感组。

1.3 研究方法

1.3.1 标本采集与处理流程

在患者开始化疗前，通过鼻咽部活检获取肿瘤组织标本。采集后的标本立即置于预冷的液氮罐中进行快速冷冻处理，随后在30分钟内转移至-80℃超低温冰箱中长期保存，所有操作均在生物安全柜内完成以确保样本质量。

1.3.2 细胞培养与分组（体外实验）

人鼻咽癌 CNE-2 细胞购自中国科学院上海细胞库，培养于含 10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素的 RPMI-1640 培养基中，置于 37℃、5% CO₂培养箱中常规培养。将 CNE-2 细胞分为 YTHDC2 高表达组（实验组细胞）和 YTHDC2 低表达组（对照组细胞）。YTHDC2 高表达组细胞转染 YTHDC2 过表达质粒，YTHDC2 低表达组细胞转染 YTHDC2 小干扰 RNA（si-YTHDC2），同时设置空白对照组（未转染细胞）和阴性对照组（转染空载体或无关 siRNA）。转染按照 Lipofectamine 3000 试剂说明书进行，转染 48h 后用于后续实验。

1.3.3 qRT-PCR 检测 YTHDC2 mRNA 表达

采用 Trizol 试剂提取组织标本及细胞中的总 RNA，反转录合成 cDNA。以 cDNA 为模板，采用 SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒进行 qRT-PCR 反应。YTHDC2 上游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGTTTATG-3'，下游引物：5'-CAGCAGCAGCAGCAGTAAT-3'；内参 GAPDH 上游引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反应条件：95℃预变性 30s，95℃变性 5s，60℃退火 30s，共 40 个循环。采用 2⁻ΔΔCt 法计算 YTHDC2 mRNA 的相对表达量。

1.3.4 Western blot 检测 YTHDC2 蛋白表达

提取组织标本及细胞中的总蛋白，采用 BCA 法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，转印至 PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭 2h，加入 YTHDC2 一抗（1:1000 稀释）和 GAPDH 一抗（1:5000 稀释），4℃孵育过夜。次日加入 HRP 标记的二抗（1:5000 稀释），室温孵育 1h。采用 ECL 化学发光试剂盒显影，以 GAPDH 为内参，采用 Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算 YTHDC2 蛋白的相对表达量。

1.3.5 CCK-8 法检测细胞顺铂 IC50

将转染后的 CNE-2 细胞以 5×10³ 个 / 孔接种于 96 孔板，培养 24h 后，加入不同浓度的顺铂（0、1、2、4、8、16μmol/L），每组设 3 个复孔。继续培养 48h 后，每孔加入 10μL CCK-8 试剂，37℃孵育 2h，采用酶标仪检测 450nm 处的吸光度（OD 值）。计算细胞存活率：细胞存活率 =（实验组 OD 值 - 空白组 OD 值）/（对照组 OD 值 - 空白组 OD 值）×100%。采用 GraphPad Prism 8.0 软件计算顺铂对细胞的 IC50 值。

1.3.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

将转染后的 CNE-2 细胞以 2×10⁵个 / 孔接种于 6 孔板，培养 24h 后，加入顺铂（浓度为 IC50 值），继续培养 48h。收集细胞，用 PBS 洗涤 2 次，加入 Annexin V-FITC 和 PI 染色液，避光孵育 15min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 观察指标

本研究主要检测了以下三个方面的实验数据：首先，通过实时荧光定量PCR和Western blot技术分别测定并比较了两组患者癌组织中YTHDC2基因在mRNA转录水平和蛋白质翻译水平的表达差异；其次，采用CCK-8法检测了具有不同YTHDC2表达水平的CNE-2鼻咽癌细胞系对顺铂药物的半数抑制浓度（IC50值），以评估YTHDC2表达水平与肿瘤细胞药物敏感性的相关性；最后，通过流式细胞术检测了经顺铂药物处理后，不同YTHDC2表达水平的CNE-2细胞发生程序性死亡（凋亡）的比例，从而分析YTHDC2表达水平对肿瘤细胞凋亡率的影响。

1.5 统计学处理

采用 SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。

2.1 两组患者癌组织中 YTHDC2 mRNA 及蛋白表达比较

见表 1。

表 1 两组患者癌组织中 YTHDC2 mRNA 及蛋白表达比较（x±s）

2.2 不同 YTHDC2 表达水平 CNE-2 细胞顺铂 IC50 及凋亡率比较

见表 2。

表 2 不同 YTHDC2 表达水平 CNE-2 细胞顺铂 IC50 及凋亡率比较（x±s）

2.3 相关性分析

Pearson 相关性分析结果显示，鼻咽癌患者癌组织中 YTHDC2 mRNA 表达水平与顺铂 IC50 值呈正相关（r=0.78，P<0.05），与细胞凋亡率呈负相关（r=-0.82，P<0.05）。

三、讨论

鼻咽癌是我国南方地区常见的头颈部恶性肿瘤，其发病与 EB 病毒感染、遗传因素及环境因素密切相关[1]。顺铂是鼻咽癌化疗的一线药物，广泛应用于临床治疗，但随着化疗疗程的延长，部分患者会出现顺铂耐药，导致治疗失败，预后不良。因此，深入探讨鼻咽癌顺铂耐药的分子机制，寻找逆转耐药的潜在靶点，具有重要的临床意义。

m6A 修饰是真核生物 mRNA 中最常见的表观遗传修饰方式之一，通过影响 mRNA 的剪接、转运、翻译及降解等过程，调控基因的表达。m6A 修饰的生物学功能主要由 m6A writer（甲基转移酶）、eraser（去甲基化酶）和 reader（阅读蛋白）共同调控。其中，m6A 阅读蛋白能够识别 mRNA 上的 m6A 修饰位点，介导下游的生物学效应[2]。YTHDC2 作为一种新型的 m6A 阅读蛋白，近年来研究发现其在多种恶性肿瘤中异常表达，并参与肿瘤的增殖、侵袭、转移及耐药等生物学过程。然而，YTHDC2 在鼻咽癌顺铂耐药中的作用及机制尚未明确。

本研究结果显示，顺铂耐药组鼻咽癌患者癌组织中 YTHDC2 mRNA 及蛋白表达水平均显著高于顺铂敏感组，提示 YTHDC2高表达可能与鼻咽癌顺铂耐药密切相关[3]。为进一步验证这一结论，我们通过体外实验调控鼻咽癌 CNE-2 细胞中 YTHDC2 的表达水平，结果发现 YTHDC2 高表达组细胞对顺铂的 IC50 值显著升高，而细胞凋亡率显著降低；反之，YTHDC2低表达组细胞对顺铂的敏感性明显增强，细胞凋亡率显著升高。相关性分析结果显示，YTHDC2 mRNA 表达水平与顺铂 IC50 值呈正相关，与细胞凋亡率呈负相关。上述结果表明，YTHDC2 高表达可能通过降低鼻咽癌细对顺铂的敏感性，抑制顺铂诱导的细胞凋亡，从而促进鼻咽癌顺铂耐药的发生。

关于 YTHDC2 促进鼻咽癌顺铂耐药的具体机制，目前尚未完全明确。推测可能与以下因素有关：①YTHDC2 作为 m6A 阅读蛋白，可能通过识别并结合凋亡相关基因（如 Bax、Bcl-2、Caspase-3 等）mRNA 上的 m6A 修饰位点，调控这些基因的表达，从而抑制细胞凋亡[4]。②YTHDC2 可能通过调控 DNA 损伤修复相关基因的表达，增强鼻咽癌细胞对顺铂诱导的 DNA 损伤的修复能力，从而降低细胞对顺铂的敏感性。③YTHDC2 可能通过激活 PI3K/Akt、MAPK 等信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活，进而参与顺铂耐药的形成。上述机制尚需进一步的实验研究证实。

本研究存在一定的局限性：①样本量较小，且为单中心研究，可能影响研究结果的普遍性；②仅通过体外实验初步探讨了YTHDC2与鼻咽癌顺铂耐药的关系，缺乏动物体内实验的验证；③未深入探讨 YTHDC2 调控鼻咽癌顺铂耐药的具体分子机制[5]。未来将扩大样本量，开展多中心研究，并通过动物实验进一步验证 YTHDC2 在鼻咽癌顺铂耐药中的作用，同时深入研究其分子机制，为逆转鼻咽癌顺铂耐药提供新的理论依据和治疗靶点。

综上所述，m6A 阅读蛋白 YTHDC2 在鼻咽癌顺铂耐药患者中高表达，其高表达与鼻咽癌顺铂耐药密切相关，YTHDC2 有望成为逆转鼻咽癌顺铂耐药的潜在分子靶点。抑制 YTHDC2 的表达可能为提高鼻咽癌顺铂化疗疗效提供新的治疗策略。

参考文献

[1]孙雯.拟南芥m6A阅读蛋白ECT1调控种子萌发的分子机制研究[D].西北农林科技大学,2025.DOI:10.27409/d.cnki.gxbnu.2025.000406.

[2]暴茹.m6A阅读蛋白MhYTP2调控苹果响应弱光胁迫的功能研究[D].西北农林科技大学,2025.DOI:10.27409/d.cnki.gxbnu.2025.000483.

[3]周柱良,吴巍芸. m6A阅读蛋白在结直肠癌中的研究进展[J].胃肠病学和肝病学杂志,2025,34(05):756-761.

[4]陈佳希.角质形成细胞中m6A阅读蛋白YTHDF1在白癜风发病中的作用及机制研究[D].中国人民解放军空军军医大学,2025.DOI:10.27002/d.cnki.gsjyu.2025.000014.

[5]黄悠阳,赵然尊. m6A甲基阅读蛋白YTHDF3调控肿瘤发生发展的研究进展[J].遵义医科大学学报,2025,48(03):318-324.DOI:10.14169/j.cnki.zunyixuebao.2025.0035.

基金项目：内蒙古自治区自然科学基金项目，项目编号：2021LHMS08007