异种脱细胞肝脏材料促脂肪间充质干细胞向肝样细胞分化的实验研究

摘要：

背景：肝移植是临床上治疗终末期肝病的唯一手段，而供体肝脏来源的匮乏促使肝脏组织工程成为目前的研究热点。

目的：探究脱细胞肝脏材料与异种来源的脂肪间充质干细胞（ADSCs）的生物相容性，及其促ADSCs向肝样细胞分化的能力。

方法：将大鼠肝脏通过十二烷基硫酸钠溶液、triton-X 100溶液门静脉泵入进行脱细胞处理，后通过蒸馏水灌洗脱毒处理，获得脱细胞肝脏材料，通过DNA定量检测验证其DNA残余量符合脱细胞材料制备标准，通过扫描电镜观察脱细胞肝脏材料制备后微观结构。结果脱细胞肝脏材料中DNA残留量为新鲜组织的0.389%，扫描电镜未见细胞残余。CCK8实验及CMFDA/PI染色见ADSCs在脱细胞肝脏材料上增殖良好，扫描电镜见ADSCs在脱细胞肝脏材料上黏附，成团生长，上述研究结果表明脱细胞肝脏材料与ADSCs具有良好的生物相容性。荧光定量PCR证实，通过诱导分化培养基培养2、5、7、14天后，脱细胞肝脏负载的ADSCs较平面培养、经诱导分化培养的ADSCs展现出ALB、AFP、CK-18、CK-19及G-6-P等肝细胞特异性基因的更高表达，蛋白质免疫印迹结果显示，接种于脱细胞肝脏材料的ADSCs高表达ALB、AFP、CK-18、CK-19及CYP1A1等蛋白，均说明ADSCs被有道分化为具有部分肝脏功能的肝样细胞。

结论：本研究说明，脱细胞肝脏材料可以负载ADSCs，有良好的生物相容性，可以促进ADSCs向肝样细胞分化。

中文关键词：脱细胞细胞外基质；肝脏；支架；脂肪组织来源的间充质干细胞；组织工程

前言

每年全球约有200万患者因终末期肝脏疾病而死亡，占世界死亡人数的3.5%[1]。目前，肝移植是最主要的临床治疗方法。然而，肝移植面临着供肝缺乏、费用高昂、终身服用抗排异药物等问题。尽管干细胞治疗可以弥补其部分缺陷[2]，但也存在定植数量少、作用时间短等局限性。肝脏组织工程通过支架负载细胞的方式，增加干细胞对肝脏定植效率、提供更适宜的细胞生长分化环境，为治疗提供了新的思路[3]。

本研究首先验证脱细胞肝脏材料DNA残余量低于50ng/mg的标准，扫描电镜观察未见细胞残余；其次脱细胞肝脏材料与ADSCs共培养后，CCK8实验及死活染色验证其生物相容性；在体外诱导分化后，通过荧光定量PCR与蛋白质免疫印迹证明了存在肝细胞相关标志物表达，肝脏脱细胞支架能促进ADSCs分化为肝细胞样细胞，为干细胞分化提供适宜的微环境，为进行下一步体内修复肝损伤奠定理论基础。

材料与方法

1.脱细胞肝脏材料准备

所有研究均经中国人民解放军总医院动物设施伦理委员会批准，并符合实验动物护理指南。大鼠给予戊巴比妥钠（0.1-0.2mL/100g）腹腔注射麻醉，备皮，固定于操作台上；纵向的腹部正中切口暴露肝门静脉，结扎门脉属支，使用套管针插管门静脉，缝线联合血管夹固定，以2.5mL/min速度静脉泵入肝素-生理盐水溶液（10u/mL）10min，分离肝脏至操作台，后以5mL/min速度泵入1%十二烷基硫酸钠(北京索莱宝科技有限公司)溶液12h，换0.5%triton-X 100溶液1h，蒸馏水灌洗至无去垢剂残留。材料冻干后密封保存至-20℃，伽马射线照射消毒后待用。

2.DNA定量

用组织研磨仪处理新鲜肝脏材料及制备的脱细胞材料。具体为取200mg冻干的脱细胞材料与200mg冻干新鲜大鼠肝脏，分别加入至组织研磨瓶内，加入1ml一蒸水后研磨30s，取出观察，多次研磨至液体均匀无颗粒为止。DNA提取采用Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA定量试剂盒（美国Thermo Fisher公司），标准曲线通过把2μg/mL DNA标准工作液按100μL、10μL、1μL、0μL量加入测试96孔板内，加入buffer至100μL/孔，测定采用多功能酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。步骤根据试剂厂商说明书操作。通过GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA）绘制标准曲线并统计。

3.扫描电镜

脱细胞肝脏材料制备完成后裁剪取材(长宽0.5-1cm、高0.2-0.5cm),样品表面用无菌PBS清洗2次，2.5%戊二醛4℃固定4h，蒸馏水洗10-20min/次，洗2次，梯度乙醇脱水(60%、70%、80%、90%、100%)重复2次，每次10min。醋酸异戊酯置换乙醇40min、六甲基二硅胺烷(HMDS)8-10min，用消毒滤纸吸干，超净台吹干，置于干燥器中保存。样品托用导电胶贴牢贴平，离子溅射真空镀膜法喷镀导电金属置样品上120s左右，具体操作：抽真空15-20min，真空度2.7-5.3Pa，离子电流数15-20mA。采用扫描电镜(S-4800,日本Hitachi公司)观察脱细胞肝脏材料的微观结构特征。

4.脂肪干细胞分离及培养

取BALB/c3日龄乳鼠，无菌条件下于腹股沟处提取脂肪组织，剪碎并用含1mg/ml I型胶原酶的磷酸盐溶液消化。于DMEM/F-12培养基中加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素作为基础培养基，在消化液中加入适量基础培养基终止消化，离心、重悬后获得原代ADSCs。原代ADSCs可置细胞培养瓶中，基础培养基培养，2天换液1次，细胞长满90%左右即可1：3传代，采用3代及以后的细胞作为实验细胞使用。课题组在前期研究中已通过流式细胞术鉴定ADSCs的特性[20,21]。

5.脂肪来源的间充质干细胞接种及诱导

脱细胞肝脏材料裁剪为8mm*8mm方形，灭菌后每片材料接种106个ADSCs，加入1mL基础培养基于细胞培养箱中培养（37℃，5%CO2）。24小时后更换培养基为肝细胞诱导培养基，诱导培养基的配置方法如下：DMEM/F-12培养基中加入10%胎牛血清、50 ng/mL HGF、25 ng/mL FGF4、30 ng/mL OSM、20 ng/mL EGF、10-6M dexamethasone、25 ng/mL aFGF、10 ng/mL bFGF,1×胰岛素转铁蛋白硒、50µmol/L Vpp[20]。

6.材料毒性验证

CCK8实验：脱细胞材料消毒、接种细胞步骤同前，实验组为脱细胞肝脏材料负载的ADSCs，对照组为平面培养的ADSCs，接种细胞量相同，分别于基础培养基培养1、3、5、7天后用磷酸盐缓冲溶液清洗3遍，加入含有10%CCK8试剂（日本Dojindo公司）、1%FBS的DMEM培养基1mL，避光孵育2h后吸出100ul细胞上清加入96孔板内，通过酶标仪（日本Dojindo公司）测量450nm波长处吸光值。每组样品重复进行3次，结果取平均值。

7.统计学分析

统计分析通过IBM SPSS Statistics 26及GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA）完成，采用t检验进行统计学分析，数据以平均值±标准差进行描述。P<0.05时结果有统计学意义。

结果

1.肝脏脱细胞材料的制备与鉴定

大鼠肝脏经SDS溶液持续灌注13小时的形态变化如图1A所示。肝脏由原红色不透明组织变为白色半透明状，脱细胞后的肝脏组织中仍可见脉管结构。

脱细胞前后肝脏组织的DNA定量分析结果表明，新鲜肝脏组织DNA含量为302.2μg/g，脱细胞肝脏材料为1.175μg/g，DNA残留量是新鲜组织的0.389%，如图1B所示。这表明脱细胞肝脏材料经过处理后，细胞成分被有效去除，只保留了细胞外基质成分。

为观察肝脏组织脱细胞后的微观结构，扫描电镜结果显示脱细胞后肝脏组织材料仅保留了完整的脉管结构，且未见细胞残留，如图1C所示。

图1 A.肝脏脱细胞过程；B.脱细胞肝脏材料的鉴定；C.扫描电镜观察脱细胞肝脏材料

2.脱细胞肝脏材料的生物相容性

将脂肪间充质干细胞种植于脱细胞肝脏材料上培养1、3、5天后，CMFDA/PI染色荧光显微镜下观察脱细胞肝脏材料上有细胞存活，并且随着培养时间延长，脱细胞肝脏材料上的细胞数量逐渐增多，聚集分布。见图2A、图2B。

扫描电镜下可见脂肪干细胞黏附于脱细胞肝脏材料上，脱细胞肝脏材料较接种脂肪间充质干细胞前纤维条索结构减少，见图2C。

以上结果说明经过脱细胞方法制备的脱细胞肝脏材料具有良好的生物相容性。

图2

3.脱细胞肝脏材料上的细胞可诱导分化为肝细胞样细胞

荧光定量PCR结果表明，通过对脱细胞肝脏材料负载的ADSCs（实验组）及平面培养的ADSCs（对照组）进行诱导分化培养，于2、5、7、14天进行检测，对照组及实验组在诱导分化过程中，基因表达量呈上升趋势，在5、7、14天三个时间点均高表达CK-18、CK-19及G-6-P基因。分化培养14天时，实验组表达CK-19、CK-18及G-6-P基因量最高，显著高于对照组（P<0.05）。

图3.CK-18、CK-19、G-6-P荧光定量PCR结果。

图4.ALB、AFP、CK-18、CK-19及CYP1A1的蛋白免疫印迹结果。

讨论

在干细胞治疗中，干细胞促进肝脏再生主要考虑通过两种方式，首先是旁分泌作用，通过干细胞移植体内后靶向宿主细胞加速自我修复，其次是自身分化产生新的肝组织，替换受损伤的肝细胞。本研究主要关注干细胞的自身分化，并通过制备脱细胞肝脏支架来提供适宜的微环境，促进干细胞向肝样细胞分化，起到替代肝脏功能，减轻肝脏损伤的作用。

在本研究中，我们证实了脱细胞肝脏支架可以为脂肪间充质干细胞提供适宜的微环境，促进其向肝细胞的分化。在PCR的实验中，我们观察到负载于支架上的干细胞在诱导培养过程中表达了肝细胞特异性基因，并且随着培养时间的延长，这种表达水平逐渐增加。

综上所述，本次研究就脱细胞肝脏材料制备方法、与ADSCs的生物相容性及促进干细胞的增殖、分化功能等方面进行研究，为下一步体内移植治疗小鼠急慢性肝损伤提供了依据。长远来看，我们的研究结果可能在干细胞肝脏再生医学与生物人工肝方面具有未来应用价值。

参考文献：

[1]Dwyer B J,Macmillan M T,Brennan P N,et al.Cell therapy for advanced liver diseases:Repair or rebuild[J].J Hepatol,2021,74(1):185-199.

[2]Liu P,Mao Y,Xie Y,et al.Stem cells for treatment of liver fibrosis/cirrhosis:clinical progress and therapeutic potential[J].Stem Cell Res Ther,2022,13(1):356.

[3]Yang W,Xia R,Zhang Y,et al.Decellularized Liver Scaffold for Liver Regeneration[J].Methods Mol Biol,2018,1577:11-23.

作者简介：赵烁，女，解放军医学院在读硕士，医师。研究方向：肝脏组织工程。Email:zs1998_8@163.com。

通信作者：阎丽，女，博士，主任医师，博士生导师。

研究概要(Key Points)：

研究问题或假设(Question or hypothesis)肝脏脱细胞支架可以模拟肝脏微环境，诱导异体来源的脂肪间充质干细胞向肝样细胞分化。

主要研究发现(Findings)肝脏脱细胞支架与异体来源的脂肪间充质干细胞有良好的生物相容性，并促进其向肝样细胞分化。

研究意义(Meanings)本研究构建的肝脏组织工程材料作为一种肝脏再生候选材料，有望为终末期肝病的治疗提供新的选择。