多聚磷酸盐作为益生素的研究进展

摘要：近年来科学家对益生菌的研究如火如荼并发现其具有广泛的生物学功能，而对其产生的生物活性分子（益生素）的研究较少。只有鉴定了发挥功能的益生素，才能真正阐明益生菌发挥作用的详细机制。多聚磷酸盐（polyP）是由磷酸根通过高能磷酸键聚合形成的线性分子，具有广泛的生物学功能。polyP作为益生素起到增强肠道屏障功能、缓解肠道炎症、修复黏膜、改善结肠炎的纤维化等作用，或许polyP是执行益生菌广泛生物学功能的益生素之一，本文评述了polyP作为益生素的功能及作用机制，为研究益生素在治疗和/或预防多种疾病方面提供一些新的认识和思考。

关键词：多聚磷酸盐；益生素；肠道屏障功能；抗纤维化；抗炎

在哺乳动物肠道中生活着1000多种细菌，它们在维持肠道的正常功能方面起到非常重要的作用。这些对健康非常重要的细菌称为益生菌，并被用于预防和/或治疗多种胃肠道疾病，如炎性肠病等。

益生菌对肠道的保护很大程度在于其产生的生物活性分子。这些活性分子被称为益生素。多聚磷酸盐（polyP）是新鉴定的益生素，具有广泛的生物学作用，如增强肠道屏障功能、缓解肠道炎症、修复黏膜、改善结肠炎的纤维化等。本文主要评述polyP作为益生素的功能及作用机制，为研究polyP作为益生素在治疗和/或预防多种胃肠道疾病方面提供新的认识和思考。

1  polyP 在微生物和宿主内的合成与降解

polyP是由磷酸根通过磷酸键聚合而成的线性分子。polyP存在于从细菌到人类的大多数生物中，其长度在几个到几千个磷酸根。在原核中，polyP主要由多聚磷酸盐激酶1利用ATP合成[1]。polyP的降解主要由多聚磷酸盐内切酶和多聚磷酸盐外切酶催化完成。它们共同维持polyP在微生物细胞内的动态平衡。

目前为止还没发现高等真核生物中具有多聚磷酸盐激酶1同系物。人类红细胞膜上的Ca2+-ATPase因其表现出ATP-polyP转移酶和polyP-ADP转移酶活性，可能是polyP激酶。此外，线粒体F1F0-ATP合成酶也可以产生polyP。而哺乳动物的胸苷酸激酶类似于细菌的多聚磷酸盐激酶2能利用polyP作为底物合成ATP或GTP。然而，在高等真核生物中却发现了多聚磷酸盐内切酶和多聚磷酸盐外切酶的同系物。如在鼠和牛脑中发现能够降解长链polyP的多聚磷酸盐内切酶[2]，而人类的转移调节子蛋白H-prune为短链polyP的特异性多聚磷酸盐外切酶，肠道内的碱性磷酸酶为高效的多聚磷酸盐外切酶[3]。此外，酵母的polyP外切酶多聚磷酸盐外切酶和人类的酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶存在41%的同源性，而且H-prune与酵母的多聚磷酸盐外切酶具有高达91%的同源性。

2  polyP在肠道上皮细胞的识别和转运途径

益生菌能与宿主共生而不会诱导肠道的炎症反应，表明宿主通过其它方式来介导其与益生菌的相互作用。通过免疫组化染色发现整联蛋白能在上皮细胞顶端表达；而整联蛋白拮抗肽——腹蝰血抑肽能与整联蛋白相互作用，并完全抑制polyP对肠道的保护作用[4]。这些结果表明polyP能够与整联蛋白相互作用。将polyP与多聚磷酸盐外切酶的polyP结合域形成的复合物用抗polyP结合域的抗体进行免疫沉淀，然后对沉淀进行分析证实polyP与上皮细胞的小窝蛋白-1形成了复合物[5]。进一步研究发现整联蛋白与脂筏蛋白小窝蛋白1结合促进肠道的内吞并调节肠道功能[6]。总之，这些结果表明polyP通过上皮细胞上的整联蛋白识别后，通过小窝蛋白-1内吞途径转运进上皮细胞。

3  polyP对胃肠道的有益作用及其机制

3.1  polyP增强肠道屏障功能

肠道上皮细胞将肠腔中的物质与肠道组织隔离开，从而阻止有害物质进入组织细胞及血液循环。这种功能称为肠道的“屏障功能”。紧密连接是屏障功能的重要部分，它存在于上皮细胞之间并将细胞膜缝合起来，由跨膜蛋白、细胞内衔接蛋白和肌动蛋白细胞骨架经相互作用形成。跨膜蛋白（包括闭合蛋白、闭锁蛋白和紧密连接黏附分子）的细胞外部分与附近的细胞相互连接，而细胞内部分与衔接蛋白（如闭合带蛋白1）以及其它蛋白]相互作用。细胞内的衔接蛋白再与肌动蛋白结合并相互作用，从而将整个紧密连接蛋白复合物锚定到肌动蛋白细胞骨架上。polyP能显著诱导结肠上皮细胞的顶端表达如闭合带蛋白1和闭合蛋白，从而改善蛙皮素诱导的急性胰腺炎小鼠的肠道屏障功能[7]。类似地，双歧杆菌来源的polyP诱导了紧密连接蛋白如紧密连接黏附分子和闭合蛋白的表达[8]。体内实验也发现polyP抑制了聚糖硫酸钠所导致的结肠细胞内闭锁蛋白-4、闭合蛋白和如闭合带蛋白1蛋白表达水平降低的现象[9]。这些结果表明polyP通过上调紧密连接相关蛋白的表达从而增强肠道屏障功能。

此外，热休克蛋白（Hsp）通过维持紧密连接蛋白的动态调节保护了肠道屏障功能，赋予肠道上皮细胞对损伤和压力更强的抵抗力。有趣的是，polyP能诱导上皮细胞表达Hsp27 [5]，从而抑制氧化剂（氯酸氨）对小肠袢黏膜通透性的损伤，增强了肠道上皮细胞F-肌动蛋白的稳定性，并减弱了30 mM 双氧水或0.3 mM 氯酸氨对F-肌动蛋白的降解，减少了聚糖硫酸钠对小鼠肠道屏障功能的损伤[4]。这些结果表明polyP通过诱导Hsp27的表达减少氧化压力等对肠道的损伤，增强了肠道屏障功能。

3.2  polyP抑制炎症反应

炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，其过度的肠道炎症导致了黏膜损伤如上皮细胞的糜烂和溃疡，从而导致细菌或有害成分进入组织细胞，进一步恶化肠道炎症。通过给小鼠口服3% 聚糖硫酸钠同时直肠给药polyP处理，结果发现经polyP处理后的小鼠的结肠皱缩情况得到改善，而且显著抑制促炎因子白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的表达[4]。类似地，每天给小鼠口服聚糖硫酸钠和polyP，结果发现聚糖硫酸钠导致的结肠缩短和炎症程度能被polyP显著改善，而且促炎因子IL-1β、肿瘤坏死因子-α和IL-6的表达水平显著降低[10]。这些结果表明polyP可能具有抗炎作用，从而改善聚糖硫酸钠诱导的急性大肠炎小鼠的肠道损伤。此外，在3% 聚糖硫酸钠诱导的慢性大肠炎小鼠模型中，polyP直肠给药显著抑制了促炎因子IL-1β、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的表达[11]，表明polyP能抑制聚糖硫酸钠诱导的慢性大肠炎。不仅如此，在2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎模型中，polyP也能抑制促炎因子IL-1β和肿瘤坏死因子-α的表达[11]。更为重要的是，一期临床试验结果发现抗肿瘤坏死因子-α治疗不能缓解的顽固性溃疡性结肠炎病人，经过长链polyP治疗能缓解他们的临床症状，内窥镜检测黏膜损伤得到愈合，而且七个病人中有六个炎症因子的mRNA表达水平降低[12]。

3.3  polyP提高肠道黏膜愈合能力

“黏膜愈合”能力强弱是肠道屏障功能好坏的指标之一。因此，找到提高黏膜愈合能力的药物对于治疗炎性肠病等疾病具有重要的意义。在聚糖硫酸钠诱导的大肠炎小鼠模型中，肠道内的polyP能直接作用并激活血小板，导致其聚集到炎症损伤的上皮细胞表面，并诱导血小板分泌促生长分子，从而促进肠道损伤的愈合[10]。有丝裂原活化蛋白激酶相关分子与上皮细胞等多种细胞的创伤愈合密切相关，为阐明促进上皮细胞生长的机制，采用蛋白印记分析有丝裂原活化蛋白激酶信号途径如细胞外信号调节激酶、c-jun N末端激酶和3-磷酸肌醇的相关分子的表达水平，结果发现细胞外信号调节激酶信号途径相关分子能被polyP处理的血小板上清显著诱导表达，而且该作用能被细胞外信号调节激酶抑制剂所抑制，而不能被其它途径的抑制剂所抑制，表明细胞外信号调节激酶信号途径负责促进损伤的愈合。不仅如此，蛋白印记实验还发现polyP处理的血小板上清还能激活细胞外信号调节激酶上游的Raf-MEK信号途径，但不能激活其它促进损伤愈合的分子如血小板来源衍化生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子和转化生长因子-β等的表达，表明polyP诱导血小板产生的活性分子激活了上皮细胞Raf-MEK-ERK信号途径，从而促进了伤口的愈合[10]。

3.4  polyP抑制肠道纤维化的持续和发展

炎性肠病的慢性炎症还易导致顽固性的溃疡和严重纤维化改变并最终导致肠梗阻。肠道纤维化的发展由信号分子如转化生长因子-β和结缔组织生长因子的激活所导致。肠道上皮细胞和巨噬细胞合成的转化生长因子-β，磷酸化后被激活从而促进smad2/3和smad4从细胞质转移到细胞核，并促进肠道成纤维细胞胶原蛋白的表达，从而诱导肠道纤维化的发展。通过WB分析发现，在聚糖硫酸钠诱导的小鼠慢性结肠炎模型中polyP抑制了转化生长因子-β、smad4和结缔组织生长因子的蛋白表达水平，表明polyP能够通过抑制这些关键分子的蛋白表达限制纤维化的持续和发展[11]。 

4  小结与展望

综上所述，polyP作为益生素起到增加肠道屏障功能、抗炎和抗纤维化等作用，但还有很多未解之谜。比如polyP对于沙门菌和志贺菌等多种病原菌的存活是必需的，但不清楚它们是否会分泌polyP到其生活环境中。无论如何，裂解的细菌会释放细胞内的polyP，表明肠道细菌死亡裂解后释放的polyP会进入到肠道，而它们将会发挥怎样的作用仍不清楚。通过从FDA批准的药物中筛选多聚磷酸盐激酶抑制剂，Jakob实验室鉴定了治疗炎性肠病的一线药物美沙拉嗪为多聚磷酸盐激酶的抑制剂[13]，而且美沙拉嗪能显著减少大肠杆菌、铜绿假单胞菌和霍乱弧菌细胞内的polyP的聚集。不仅如此，服用美沙拉嗪后的小鼠或人类肠道微生物群细胞内的polyP的水平降低。美沙拉嗪的作用靶点一直存在争议，如果多聚磷酸盐激酶是其作用靶点并通过抑制polyP的产生发挥治疗作用，为何病原菌来源的polyP和益生菌来源的polyP会起到截然相反的作用。或许polyP的长度影响了polyP的功能，比如经不同长度的polyP处理离体小肠袢在氯化铵存在时对H3-甘露醇通透率的影响，结果发现polyP对肠道的屏障功能的保护作用与polyP长度相关，其长度越长强度越大，当长度达450个磷酸根时不再增加[12]，表明polyP的长度对其生理作用非常重要并最终决定其是敌是友。有趣的是，哺乳动物肠道内的碱性磷酸酶为高效的多聚磷酸盐外切酶[3]，具有控制肠道微生物群的组成和抗炎作用，而且鞘磷脂酶样磷酸二酯酶与酵母的多聚磷酸盐外切酶存在41%的同源性，并能钝化血小板活化因子，该基因点突变与肠癌相关[14]。另外，人类H-prune鉴定为特异的短链polyP水解酶，对长链polyP（大于25个磷酸根）的降解速率较慢，并且其催化活性能够被长链polyP抑制。因此，进一步研究肠道细菌聚集和分泌polyP的作用和机制以及肠道如何识别和调控polyP的长度和水平对预防和/或治疗肠道疾病非常重要。

虽然还有很多未解之谜，但polyP作为益生素治疗人类相关疾病具有诱人的应用前景。因为益生菌发挥作用的方式之一是其产生的益生素，但益生素的合成并不稳定，会受到各种因素的影响[15]。不仅如此，在病原菌增殖或服用抗生素等不适宜的条件下，益生菌产生或分泌polyP的能力降低，导致肠道稳态失衡和肠道功能紊乱。更重要的是，口服polyP纳米颗粒不会导致急性大肠炎小鼠肠道微生物稳态的破坏[9]。因此直接服用polyP或许比使用益生菌进行治疗效果更好。

参考文献：

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*湖北民族大学大学生创新创业训练计划项目（批准号: 202310517008）资助

作者简介：陈琪邦（2003.03-），男，就读学校湖北民族大学/医学院、研究方向：临床医学。

▲通讯作者简介：石廷玉，男、博士、副教授、湖北民族大学医学部