头颈部鳞癌组织中miRNA-451及c-myc表达水平变化及其意义分析

摘要:目的：分析头颈部鳞癌组织中微小RNA-451（miRNA-451）与c-myc表达水平变化情况，以期为临床患者准确进行疾病判断和预后评估提供指导。方法：选取41例头颈部鳞状细胞癌患者，治疗时间段为2023年7月至2024年6月，收集患者头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织与转移淋巴结组织并应用免疫组化法检测c-myc阳性表达情况，收集患者头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织与正常喉黏膜组织并应用原位杂交法检测miRNA-451阳性表达情况，比较头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织与正常喉黏膜中miR-451阳性表达率，比较颈部转移淋巴结与颈部反应性增生淋巴结中miR-451阳性表达率，比较头颈部鳞癌与转移淋巴结中c-myc阳性表达率。结果：相比于正常喉黏膜组织，肿瘤组织中miR-451阳性表达率明显更低（P<0.05）。相比于颈部反应性增生淋巴结，颈部转移淋巴结有着显著更低的miR-451阳性表达率（P<0.05）。相比于头颈部鳞癌组织，转移淋巴结中有着更高的c-myc阳性表达率（P<0.05）。结论：头颈部鳞癌组织及颈部转移淋巴结中miR-451阳性表达率降低，c-myc阳性表达率升高，与头颈部鳞癌进程存在关联，miR-451丢失可能造成c-myc过表达，两者均可能在头颈部鳞癌发病和进展过程中发挥作用。

关键词：头颈部鳞癌；微小RNA-451；c-myc；阳性表达率；疾病进展

作为头颈部发病率最高的恶性肿瘤，头颈部鳞癌在全世界恶性肿瘤发病率中位居第6位，局部转移与侵袭为影响患者预后以及生存质量的危险因素[1-2]。为了保证治疗的有效性和精准性，在治疗前必须明确患者是否存在局颈部淋巴结转移等现象，从而为临床制定精准且有效的治疗方案提供指导[3]。微小RNA（miRNA）能够对细胞功能发挥调节作用，miRNA-451表达水平与多种疾病存在关联，可作为癌基因、肿瘤抑制因子及生物标志物[4]。c-myc可对肿瘤细胞周期发挥调控作用，一旦c-myc被激活并出现表达失控现象后可对多种细胞增殖发挥作用，易导致肿瘤发生以及进展过程加速[5]。本次研究以头颈部鳞状细胞癌患者41例为研究对象，患者接受治疗的时间段为2023年7月至2024年6月，分析头颈部鳞癌组织中微miRNA-451与c-myc表达水平变化情况，从而为临床明确诊断头颈部鳞状细胞癌及患者是否出现颈部淋巴结转移现象提供指导，现报告如下：

1资料与方法

1.1一般资料

选取41例头颈部鳞状细胞癌患者，包括下咽癌10例、喉癌13例、鼻咽癌10例、口腔癌8例，男性患者31例、女性患者10例，23~79岁，平均年龄：（48.56±5.09）岁。16例患者检出颈部反应性增生淋巴结，25例患者检出颈部转移淋巴结。研究方案由医学伦理委员会批准。

纳入标准：①均为原发病且经组织病理检查确诊为头颈部鳞状细胞癌；②以头颈部为原发部位；③患者基本临床资料及病理组织相关资料完整；④首次发病；⑤患者意识清晰且自愿配合本次研究。

排除标准：①合并其他类型癌症者；②接受免疫治疗、放疗或者化疗者；③取材部位不当者；④伴凝血功能障碍或血液系统疾病者；⑤伴全身感染性病变者；⑥伴肝脏、肾脏等脏器功能衰竭者。

1.2方法

收集患者头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织与转移淋巴结组织，应用免疫组化法检测c-myc表达水平，应用10%甲醇溶液对组织标本进行固定，连续固定时间达24h，然后实施石蜡包埋并制作切片（厚度：4μm），以檬酸钠缓冲液修复抗原。实施过氧化氢溶液（浓度：3%）滴加后在室温下孵育15min，应用磷酸缓冲盐溶液（PBS）连续清洗3次。应用山羊血清（浓度：10%）封存（时间：30min），滴入一抗，次日以PBS连续进行3次清洗，滴入二抗后再次于室温下孵育（时间：30min），染色并脱水后封片并在双盲显微镜下检查。以下为阳性判定标准：阳性表达占比不超过5%计0分：阳性表达占比为6%-25%计算1分：阳性表达占比为26%-50%计2分，阳性表达占比超过50%则计3分。染色强度判定标准如下：不着色：0分；颜色为淡黄色：1分；颜色为棕黄色：2分；颜色呈棕褐色：3分。若阳性表达率与染色强度之和高于3分则视为阳性，反之则为阴性。

收集患者头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织与正常喉黏膜组织（确保所取组织与肿瘤病灶组织边缘距离不少于3cm），应用原位杂交法检测miRNA-451表达阳性率，严格按照杂交试剂盒说明书进行操作，首先实施石蜡组织标本连续切片，厚度约为6-8μm，脱蜡后以3%过氧化氢对内源性过氧化物酶活性实施灭活，采用蛋白酶处理后在室温下以1%多聚甲醛固定，滴加预杂交液20μL并在38-42℃下过夜，以SCC严格浸洗，2×SSC时间为5min、2×SSC时间为5min、0.5×SSC时间为15min，0.2×SSC时间为15min37℃，在37℃下连续孵育30min，滴加SABC与生物素化地高辛，于37℃下分别孵育60℃、30℃，然后以DAB染色，通过显微镜控制染色时间，待取得理想的染色效果后以苏木素复染，经酒精脱水-二甲苯透明-中性树脂封片后完成操作。在5个高倍视野下观察miRNA-451阳性细胞数，阳性标准如下：阳性细胞数为10%-50%，阴性标准如下：阳性细胞数<10%，以阳性细胞数量高于50%为强阳性。

1.3观察指标

（1）比较头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织与正常喉黏膜中miR-451b阳性表达率。

（2）比较颈部转移淋巴结与颈部反应性增生淋巴结中miR-451b阳性表达率。

（3）比较头颈部鳞癌与转移淋巴结中c-myc阳性表达率。

1.4统计学分析

以SPSS 26.0分析数据，均值±标准差（）表达符合正态分布的计量资料，通过独立样本t检验分析组间均值差异；案例数与百分比（例%）表示计数资料，通过χ2检验比较样本率。P值<0.05：差异具有统计学意义。

2结果

2.1比较头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织与正常喉黏膜中miR-451阳性表达率

相比于正常喉黏膜组织，肿瘤组织中miR-451阳性表达率明显更低，miR-451b阳性表达率差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织与正常喉黏膜中miR-451阳性表达率对比（）

2.2比较颈部转移淋巴结与颈部反应性增生淋巴结中miR-451阳性表达率

相比于颈部反应性增生淋巴结，颈部转移淋巴结有着显著更低的miR-451阳性表达率且差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2颈部转移淋巴结与颈部反应性增生淋巴结中miR-451阳性表达率（）

2.3比较头颈部鳞癌与转移淋巴结中c-myc阳性表达率

相比于头颈部鳞癌组织，转移淋巴结中有着更高的c-myc阳性表达率，c-myc阳性表达率差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3头颈部鳞癌与转移淋巴结中c-myc阳性表达率（）

3讨论

miRNA-451所在部位为染色体171lqll22，为存在多种功能的miRNA，在肿瘤细胞生长、增殖和转移、侵袭等生物学行为中发挥着重要作用，在体循环中还可避开RNA酶降解。miRNA-451在多种肿瘤中存在异常表达现象，如甲状腺癌、肺癌等多[6-7]。研究[8]表明，miRNA-451表达水平下降属于肺小细胞肺癌患者不良预后的独立影响因素，与临床分期及淋巴结转移等存在重要关联，可为临床病选择治疗新靶点提供指导。EMT在肿瘤侵袭和转移过程中发挥着重要作用，N-cadherin、Vimentin等间质表型的获得与β-catenin、E-cadherin等肿瘤细胞上皮表型的丢失可使肿瘤细胞经细胞外基质向血管及淋巴管中迁移，继而使得转移级联反应被启动[9]。miRNA-451可通过调控信号通路的方式使EMT进程受到影响，继而使得肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭受到影响。

C-myc在细胞生命活动中可发挥至关重要的作用，C-myc转录与调节作用包括直接转录激活作用，其他蛋白质介绍导的间接转录调控作用也包含在内，可通过对TRRAP发挥作用的方式提高组蛋白乙酰转移酶活性，针对目的基因转录能够发挥调控作用，故而可在染色质水平上的转录调控过程中发挥作用，此外，C-myc还可调控细胞周期，能够不同程度地作用于细胞的增殖与凋亡[9]。静止期细胞C-myc表达量较低，受到生长因子刺激时，C-myc迅速积累且在细胞周期进程过程中能够保持较高的表达水平，待子细胞进入至静止期后方本底水平方可恢复。C-myc过表达可导致p19/p14ARF/p53等保护性通路被激活以降低肿瘤形成风险[10]。一旦保护性通路发生突变而受损，可导致C-myc表达失控，致使癌症发生。C-myc在不同组织细胞中表达活性也存在较大的差异，针对C-myc进行深入分析有望为临床治疗头颈部鳞癌提供分子靶点。

D-此次研究中，肿瘤组织中miR-451阳性表达率低于正常喉黏膜组织（P<0.05），颈部转移淋巴结miR-451阳性表达率低于颈部反应性增生淋巴结（P<0.05），颈部转移淋巴结c-myc阳性表达率高于头颈部鳞癌组织（P<0.05），提示miR-451及c-myc阳性表达与头颈部鳞癌及淋巴结转移存在关联，提示miR-451在头颈部鳞癌组织及颈部转移淋巴结中低表达，c-myc在颈部转移淋巴结中高表达，miR-451表达缺失可能参与到头颈部鳞癌的发生和发展过程中，检测c-myc阳性表达情况可为临床判断和分析患者是否出现颈部淋巴结转移现象提供指导[11-12]。

综上所述，头颈部鳞癌组织及颈部转移淋巴结中miR-451阳性表达率下降且c-myc阳性表达率上升，miR-451及c-myc阳性表达率与头颈部鳞癌进程存在关联，c-myc过表达可能与miR-451丢失存在关联，两者均可作用于头颈部鳞癌发病和进展过程中，有望为临床选择新的治疗靶点提供指导。

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课题项目：mir-451调节的c-myc在头颈部鳞癌发生及转移中的作用机制（编号：2021B01091）

通讯作者：邱海涛