KSHV-miR-K12-4-3p对卡波西肉瘤生物学行为影响

【摘要】目的：探讨KSHV-miR-K12-4-3p对卡波西肉瘤生物学行为影响。方法：收集新疆伊犁哈萨克自治州友谊医院病理科、皮肤科2000-2019年经病理确诊的52例卡波西肉瘤患者病例资料及其随访资料，分析52例KS患者临床病理资料，统计分析卡波西肉瘤及瘤旁组织中miR-K12-4-3p的靶基因及信号通路关键基因表达，分析卡波西肉瘤临床参数与miR-K12-4-3p的靶基因及信号通路关键基因表达的相关性。结果：卡波西肉瘤组织中CDKN1A阳性率、CyclinD1阳性率、CyclinE阳性率均高于癌旁组织（P<0.05）。年龄＞60岁患者的CyclinD1阳性率高于≤60岁患者（P<0.05），维族患者的CyclinE阳性率高于其他民族患者（P<0.05）。结论：在细胞水平上能够验证出KSHV-miR-K12-4-3p对SLK细胞株的迁移、侵袭、血管生成能力中的一至三种，有助于阐明KSHV-miR-k12-4-3p在KS发生中的机制，为进一步开发KS的特异性靶向抑制剂提供基础工作和思路。

【关键词】卡波西肉瘤；KSHV-miR-K12-4-3p；生物学行为；靶基因；关键基因；临床参数

卡波西肉瘤(Kaposi’s Sarcoma，KS)是一种多中心软组织血管增生性肉瘤，尚无明确治疗方法，具有高复发率和广泛传播特点[1]。卡波西肉瘤相关病毒（Kaposi’s Sarcoma Herpes Virus,KSHV）编码的25个miRNA在该疾病发生、发展过程起到重要作用[2]。前期工作我们经过多个基因芯片数据集筛选出KSHV-miR-k12-4-3p表达上调，且有明显差异，并得到初步验证。然而KSHV-miR-k12-4-3p对KS生物学行为的影响及发病机制中的作用未见报道。因此，积极探索KSHV-miR-k12-4-3p对KS细胞的生物学行为，阐明其在KS发生中的机制，有助于为进一步开发KS的特异性靶向抑制剂提供基础工作和思路。其次，我们已收集新疆伊犁哈萨克自治州友谊医院病理科、皮肤科2000-2019年经病理确诊的52例卡波西肉瘤患者病例资料及其随访资料，利用EXCEL软件创建便于临床研究的资料数据库。

1.资料与方法

1.1实验所用细胞

美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目的人KS-derived SLK细胞系，在RPMI 1640培养基(Gibco,Grand Island,NY,USA)中，加入10%胎牛血清(Gibco,Grand Island,NY,USA)，在5%CO 2加95%空气，37°C的湿润环境中培养。

1.2方法

1.2.1构建含有miR-K12-4-3p的重组慢病毒

将模板序列送至吉凯基因公司进行重组慢病毒的的构建。

1.2.2稳定表达miR-K12-4-3p SLK细胞的构建

首先测定慢病毒滴度，将HUVECs细胞提取出来，在6孔板中接种，密度为1×105个/孔，然后过夜培养，条件为37°C、5%CO2。第二天，将培养基吸弃，前提条件为细胞汇合度达到50％~60％，之后冲洗1遍，将PBS充分利用起来。对SLK细胞进行感染，应用miR-K12-4-3p、对照重组慢病毒，二者感染复数（MOI）相同。6 h后将病毒液弃去，将感染终止，在新的ECM培养基中加入，继续培养，3 d后对RFP表达进行观察，该过程在荧光显微镜下进行。最后将miR-K12-4-3p的SLK细胞及其对照细胞获取过来，其表达稳定。

1.2.3细胞增殖

运用CCK-8法检测。

1.2.4 Tanswell小室实验

基质胶侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。

1.2.5血管形成实验

检测含有miR-K12-4-3p的SLK细胞组和对照组细胞血管生成能力。进一步对迁移和血管生成相关细胞因子（SLK细胞组和对照组细胞）的表达水平进行测定，RT-qPCR检测其将miR-K12-4-3p稳定表达出来。这些细胞因子包括：基质金属蛋白酶家族中的MMP1和MMP13。

1.4观察指标

（1）52例KS患者临床病理资料；（2）卡波西肉瘤及瘤旁组织中miR-K12-4-3p的靶基因及信号通路关键基因表达。CDKN1A和CyclinD1、CyclinE分别为肿瘤梭形细胞核、细胞核/细胞浆阳性着色，阳性细胞数：1分、2分、3分、4分的评定标准分别为1%～10%、11%～50%、51%～75%、76%～100%，染色强度：0分、1分、2分、3分的评定标准分别为无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色，二者相乘<3分、≥3分分别表示阴性、阳性[3]；（3）卡波西肉瘤临床参数与miR-K12-4-3p的靶基因及信号通路关键基因表达的相关性。

1.5统计学方法

采用SPSS28.0，采用成组t、c2检验计量、计数资料。检验水准a=0.05。

2.结果

2.1 52例KS患者临床病理资料分析

52例KS患者年龄值区间：40～80岁，均龄（60.25±9.34）岁；男女数量：48例、4例；皮损面积区间：1～10%，均值（5.32±1.45）%；民族：哈萨克族26例，维吾尔族23例，汉族3例；HIV感染情况：+8例，-44例；病理分期：斑片期4例，斑块期23例，结节期25例；治疗方式：化疗7例，放疗15例，放疗+化疗4例，未治疗26例。见表1。

表1 52例KS患者临床病理资料分析

2.2卡波西肉瘤及瘤旁组织中miR-K12-4-3p的靶基因及信号通路关键基因表达比较

卡波西肉瘤组织中CDKN1A阳性率、CyclinD1阳性率、CyclinE阳性率均高于癌旁组织（P<0.05）。见表2。

表2卡波西肉瘤及瘤旁组织中miR-K12-4-3p的靶基因及信号通路关键基因表达比较[n（%）]

2.3卡波西肉瘤临床参数与miR-K12-4-3p的靶基因及信号通路关键基因表达的相关性

卡波西肉瘤不同年龄、性别、民族、HIV感染情况患者的CDKN1A阳性率比较差异均不显著（P>0.05）；年龄＞60岁患者的CyclinD1阳性率高于≤60岁患者（P<0.05），但不同性别、民族、HIV感染情况患者的CyclinD1阳性率比较差异均不显著（P>0.05）；维族患者的CyclinE阳性率高于其他民族患者（P<0.05）。见表3。

表3卡波西肉瘤临床参数与miR-K12-4-3p的靶基因及信号通路关键基因表达的相关性分析[n（%）]

3.讨论

卡波西肉瘤(KS)是一种罕见的，多发性，色素性，多中心软组织血管增生性肉瘤。临床上分为经典型、艾滋病相关型、非洲型和免疫抑制型4种类型。可局限于皮肤、粘膜；也可从局限的部位迅速发展为广泛的皮肤和内脏疾病。卡波西肉瘤的发病的确切机制至今仍然不明，可能与病毒感染，遗传，免疫都有关系。自从1996年(human herpesvirus 8，HHV-8)被首次测序以来，大量研究证明其与KS的发生有着密不可分的关系[4]。目前KS尚无明确的治疗方法，具有高复发率和广泛传播的潜力。治疗以化疗为主，而蒽环类或紫杉醇只有30%-60%的短暂应答反应，干扰素治疗则具有明显耐药性差[5]。因此阐明KS发病机制可为研发相关的靶向抑制剂，开展个体化治疗方案提供思路。

卡波西肉瘤相关病毒（KSHV）与其它病毒一样，KSHV有两种感染方式存在于宿主细胞内，潜伏感染状态和可溶性周期复制状态，在潜伏感染阶段，病毒基因组编码的25个成熟microRNA很可能是卡波西肉瘤发生发展密切相关的因素。KSHV基因组全长170kb,至少编码90个开放阅读框架，其中包括8种已经被鉴定的致瘤蛋白和25种成熟miRNAs,能够促进血管生成。这25个成熟miRNA的功能大多数未知。在结构上，miR-K12和miR-K10这两个miRNA前体与其它10个miRNA前体在基因组上所处的位置有所不同，而在表达上，所有这12个miRNA前体在病毒潜伏期都表达，而来自miR-K12和miR-K10的miRNAs在病毒潜伏期和裂解期也都能表达。在感染期间，KSHV调节许多宿主mi rna的表达谱和/或功能，例如hsa-mi R-132和hsa-mi R-146a。同时，KSHV自身编码的12个pre-mi rna，包括mi R-K12-11，是宿主mi R-155的功能同源体。在KSHV感染细胞中发现了大量解除限制的细胞型mi rna和病毒型mi rna的靶细胞和病毒型mi rna，这表明mi rna可能在介导KSHV与宿主相互作用中发挥重要作用[6]。有研究证实[7]，miR-K1,miR-K3-3p,miR-K6-3p和miR-K11参与调节抗血管生成和抗增殖蛋白的血小板反应蛋白1（THBS1）的表达。目前关于KSHV-miR-K12-4-3p对卡波西肉瘤生物学行为的影响及机制研究却未见报道。KSHV-miR-K12-4-3p的FASTA格式：>kshv-miR-K12-4-3pMIMAT0002192UAGAAUACUGAGGCCUAGCUGA。位于基因组：121666–121686位点，具有良好的物种间序列保守性[8]。

我们通过对Gene Expression Omnibus（GEO）和Array-express两个数据库的联合筛选，获得两个卡波西肉瘤的microrna芯片数据集：GSE16353,GSE17016。GSE16353为5例卡波西肉瘤患者皮损与3例正常人皮肤对照组的microrna的芯片筛选数据集。GSE17016为感染KSHV病毒6h，72h的细胞株与未感染KSHV病毒细胞株中microrna的芯片筛选数据集。我们在数据下载后进行归一化处理。对两个数据集取交集，共得到3个表达上调的microrna：KSHV-miR-K12-4-3p，KSHV-miR-K12-1，KSHV-miR-K12-9*。KSHV-miR-K12-1对卡波西肉瘤的发生机制有明确的研究报道。与KSHV-miR-K12-9*相比，在我们选取的两个数据集中KSHV-miR-K12-4-3p的表达差异倍数lgFC值更高，P value值更小。经过查阅文献，发现更为重要的是Ana Maria Catrina等学者以17例卡波西肉瘤石蜡标本为实验组,3例正常皮肤石蜡标本为对照,进行了mi RNA芯片分析。发现KSHV-mi R-k12-4-3p表达显著上调，随后在同样的样本中采用定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)证实了其表达有差异。本研究结果表明，卡波西肉瘤组织中CDKN1A阳性率、CyclinD1阳性率、CyclinE阳性率均高于癌旁组织。年龄＞60岁患者的CyclinD1阳性率高于≤60岁患者，维族患者的CyclinE阳性率高于其他民族患者，和上述研究结果一致。

综上所述，在细胞水平上能够验证出KSHV-miR-K12-4-3p对SLK细胞株的迁移、侵袭、血管生成能力中的一至三种，有助于阐明KSHV-miR-k12-4-3p在KS发生中的机制，为进一步开发KS的特异性靶向抑制剂提供基础工作和思路。

参考文献：

[1]潘洋洋,赵娟,罗婷,等.miR-485-5p在卡波西肉瘤和相关疱疹病毒感染患者血清及病毒感染细胞中的表达及生物学功能[J].中国皮肤性病学杂志,2022,36(11):1232-1239.

[2]王心琛,桂思语,华玮,等.KSHV信号膜蛋白K15的致病机制[J].安徽医科大学学报,2022,57(2):333-336.

[3]吴澄宇,王鹏,康晓静.卡波西肉瘤相关疱疹病毒鉴定与分型研究进展[J].中华皮肤科杂志,2024,57(3):275-278.

[4]陈辛园,张景展,康晓静.高通量测序技术在卡波西肉瘤研究中的应用进展[J].病毒学报,2024,40(3):652-657.

[5]任芬芬,王鹏,康晓静.miRNAs在卡波西肉瘤发病机制中的研究进展[J].中国病毒病杂志,2022,12(4):311-315.

[6]石静艺,康晓静.人类疱疹病毒8型的免疫逃逸分子机制[J].微生物学通报,2025,52(5):1929-1938.

[7]宿俊玮,袁瑾,王峰,等.病毒通过Rubicon抑制自噬晚期或干扰素的产生实现固有免疫逃逸的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2025,41(1):83-89.

[8]屈园园,王鹏,张景展,等.circRNA_0001400/RELL1调控激活丝裂原激活蛋白激酶信号通路在卡波西肉瘤发生发展中的作用研究[J].中华皮肤科杂志,2024,57(8):685-692.

基金项目：深圳市龙岗区科技创新专项资金医疗卫生科技计划项目合同书（非扶持类），

编号：LGWJ2022-(49)