CFTR与肠道菌群的研究进展

摘要：肠道菌群对维持机体内环境稳定发挥重要作用，一些疾病的发生与肠道菌群的失调互为因果关系。囊性纤维化（CF）的发生是由于囊性纤维化跨膜转导调节基因的突变，囊性纤维化在临床通常伴随多种并发症, 患者主要表现为消化系统和呼吸系统异常, 如肺部反复感染,导致肺功能衰竭，是CF最常见的死亡原因。肠道菌群失调是CF患者的临床上的主要症状之一，在CF患者中肠道微生物丰富度和多样性发生着变化，不仅细菌在CF的发展中扮演着重要角色，真菌也同样发挥重要的作用。CF患者粪便中还表现出一些炎症标志物，炎症标志物的研究对CF的诊断有潜在用途。目前对CF的治疗主要依赖抗生素，但抗生素的使用会使肠道菌群发生短期和长期的变化，随着对CFTR基因的研究，针对CFTR的基因治疗陆续出现，不管单联、双联或者三联CFTR调节剂均能有效改善CF病情，但由于CFTR基因突变的多样性，且价格昂贵，在临床应用时间尚短，许多风险及药物不良反应尚未十分明确，以有研究证明益生菌制剂可以通过改善肠道屏障功能和调节免疫反应进而减轻肺部恶化的程度。

关键词：肠道菌群；囊性纤维化；囊性纤维化跨膜转导调节因子；益生菌；基因治疗

Abstract: “Intestinal flora plays an important role in maintaining the stability of the body's internal environment. .The occurrence of some diseases is mutually causal with the imbalance of intestinal flora. Cystic fibrosis (CF) occurs due to mutations in genes that regulate cystic fibrosis transmembrane transduction. The main clinical manifestations of cystic fibrosis patients are digestive and respiratory system abnormalities, repeated lung infections, leading to lung failure, which is the most common cause of death in CF. The imbalance of intestinal flora is one of the main clinical symptoms of CF patients, and the richness and diversity of intestinal microorganisms in CF patients are changed. Not only bacteria play an important role in the development of CF, but also fungi. There are also some inflammatory markers in the stool of CF patients, and the study of inflammatory markers has potential use in the diagnosis of CF. At present, the treatment of CF mainly depends on antibiotics, but the use of antibiotics will cause short-term and long-term changes in intestinal flora. With the research on CFTR gene, gene therapy for CFTR has emerged one after another, and no matter single, double or triple CFTR regulators can effectively improve CF condition. However, due to the diversity of CFTR gene mutations and the high price, CFTR can be effectively improved. The clinical application time is still short, and many risks and adverse drug reactions are not very clear. Studies have shown that probiotics can reduce the degree of lung deterioration by improving intestinal barrier function and regulating immune response. ”

 Key words: intestinal flora；cystic fibrosis；cystic fibrosis transmembrane transduction regulators,；probiotics, gene therapy

 肠道菌群是寄居在人体肠道内的微生物群落的总称，是维持机体内环境稳定的重要因素。肠道微生态与人体互相依存，与机体的感染、营养、免疫及代谢密不可分。婴儿出生后一小时，细菌就开始在肠道中定植并且数量不断增加，构成一个相对稳定的微生物群，与宿主维持着动态平衡，如果平衡遭到破坏，肠道菌群就会失调，引起疾病的发生，比如：II型糖尿病、肥胖、肝硬化、抑郁症等[1]。这些疾病与肠道微生态失调互为因果关系：这些疾病造成机体应激状态，而肠道菌群失调会进一步加重病情[2]。肠道内定植着有益菌和致病菌。有益菌能通过多种作用对宿主产生有益的影响，例如调节肠道内的pH值、阻止致病菌过度繁殖、促进肠道蠕动、缓解腹泻、分解人体不能消化的纤维、多糖和蛋白等物质，产生人体所需维生素和氨 基酸等，并促进钙、镁、锌等元素的吸收。致病菌通过自身蛋白或者分泌毒素等方式使肠道发生炎症反应、腹泻等一系列疾病。

囊性纤维化（Cystic fibrosis，CF）是一种常染色体隐性遗传性疾病，是由囊性纤维化跨膜转导调控因子（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突变，CFTR蛋白功能缺陷或缺失所致上皮细胞对Cl-离子转运异常造成的[3]。CF是一种严重的多器官疾病，常累及肺、消化道、肝脏、胰腺和生殖系统[4]。CF会导致一系列胃肠道并发症，如：胰腺功能不全、肠道运输减慢、吸收不良和梗阻等，其中肠道菌群失调是CF的重要症状之一 [3]。提示CFTR与肠道微生态稳态密切相关。因此，本文就囊性纤维化与肠道菌群之间的研究进展进行综述。

1、CFTR与囊性纤维化

CFTR蛋白是一种表达在多个器官 (包括呼吸系 统、消化系统、生殖系统、汗腺等) 上皮细胞顶膜的糖蛋白，由1480个氨基酸组成，在cAMP调节下参与氯离子的跨膜转运。CFTR蛋白具有两组六个跨膜结构域(TMD)、两个核苷酸结合结构域(NBD)和一个调节(R)结构域的结构。其中NBDs参与CFTR氯离子通道的门控，R结构域在细胞内，通过结合三磷酸腺苷与蛋白激酶A磷酸化激活, 对机体电解质和体液的吸收及分泌起重要作用[6]。CFTR蛋白功能的缺失和缺陷会影响CFTR蛋白的表达, 导致Na+和Cl-跨膜运输障碍，使上皮细胞对阴离子无法正常转运, 水分泌减少, 黏膜表面脱水并酸化, 最终导致多个器官腔道中黏液过于黏稠, 易聚积并堵塞导管，最终损害肺、胰腺、肝脏和肠道等器官功能[4]，从而导致囊性纤维化的发生。CF是一种致死性遗传病，其中, 肺部的反复感染、 炎症和呼吸衰竭是导致 CF 患者死亡的主要原因[5]，若不经过治疗，患者存活年龄中位数约为5岁【参考】。目前CFTR已发现2000多个突变基因，最常见的是第508位苯丙氨酸缺失（△F508）。

2．囊性纤维化与肠道菌群失调

肠道微生物在免疫、代谢和维持内环境稳态方面发挥重要作用，同时还会影响宿主的营养吸收。在CF患者小肠中，绒毛表面堆积的黏液为细菌提供锚点，同时黏液阻塞隐窝，损害Paneth细胞的防御能力，从而使CF患者肠道细菌过度生长，发生微生物失调[7]。最近，微生物非培养技术的发展给CF患者肠道微生物的组成带来了新的见解，证明了CF患者肠道中确实存在菌群的失调，而且揭示了CF患者肠道微生物的多样性。De Lisle等[8]人为了测量CF小鼠和野生型小鼠的细菌负荷，从分离的野生型和CF小鼠的小肠中取肠腔内容物，提取DNA，用普通细菌16S PCR引物和QPCR技术对细菌DNA进行定量测定，发现CF小鼠每个肠道的16S拷贝数是野生型小鼠的40倍以上。Sun等[9]人对两种不同品种的CF雪貂进行深度测序和元基因组系统发育分析，结果显示两种CF雪貂中的细菌丰度是非CF配对对照组的2.1倍和7.5倍。另一项研究表明，与野生型小鼠相比，CFTR基因敲除小鼠胃肠道细菌群落的丰富度、均匀度以及多样性都显著下降，并且表现出明显丰富的分枝杆菌和脆弱类杆菌[10]。

在婴儿期CF患者肠道和呼吸道都有自己独特的微生物群，但肠道和呼吸道有一个共同的细菌核心，如：链球菌和韦洛氏菌，肠道和呼吸道的种群随着时间的推移发生相似的变化[11]。Nielsen等[12]人研究发现，2-17岁CF儿童中，与CF相关的肠道菌群的丰富度和多样性显著下降，并且肠道微生物丰富度随年龄增长而增加，但CF人群的肠道微生物与健康人相比丰富度总体上较低。另一项相似的研究显示，对CF儿童横断面和纵断面进行研究发现，CF患者和同胞的微生物区系有相似的物种丰富度，但CF患者中，总体趋势是时间稳定性较低，物种丰富度较低[13]。在CF成人中研究发现，与对照组相比，CF患者的肠道微生物区系明显不同，菌落总数增加，类杆菌显著减少，而且两组之间的代谢物也有显著差异[14]。

长期以来，人们对CF的研究主要集中在细菌的菌群失调上，但越来越多的证据表明，真菌在CF患者中也扮演着重要的角色。近些年来，在CF患者中分离出不同的真菌菌属，比如：曲霉属(Aspergillus spp.)、塞多孢霉属(Scedosporium spp.)、外生孢子属(Exophala spp.)和假丝酵母属(Candida spp.)，其中烟曲霉菌的患病率在10%到57%之间[15, 16]。

CF患者的治疗主要依赖抗生素，但抗生素治疗会导致正常人类微生物区系的组成发生短期和长期的变化。Jakobsson等[17]人对接受抗生素治疗的CF患者进行长达四年的监测，抗生素治疗一周后观察到细菌多样性降低，虽然每个人的微生物区系对抗生素治疗的反应是不同的，但可以观察到一些总体趋势，例如治疗后放线菌数量急剧下降。在短期中抗生素治疗后的微生物多样性可以恢复到治疗前的状态，但在某些情况下，微生物区系在治疗后长达四年的时间里仍然处于扰动状态，在治疗四年后发现了高水平的大环内酯类抗药性基因erm(B)。抗生素治疗的长期后果是耐药基因的存在，抗药性菌株可以在没有选择压力的情况下持续存在人类宿主环境中，导致疾病的变化[18]。

3、肠道炎症标志物与CF

CF的主要标志是肠炎，当菌群失调、胰腺分泌不足导致PH降低，黏液增厚，从而导致细菌过度生长并且组成发生变化，就会刺激炎症的发生，最终引起炎症反应，粪便中会携带一些炎症标志物，比如：钙保护素、白蛋白、IL-1、IL-8、中性粒细胞弹性蛋白酶、肿瘤坏死因子-α、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白[19]。在CF研究中，使用最广泛的非侵入性粪便标志物是钙保护素，在小肠中，钙保护素由中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等细胞释放，并且钙保护素的表达水平与年龄有着明显的相关性。Garg等[20]人对0-10岁CF儿童粪便进行时间趋势分析，发现CF组0-1岁儿童粪便钙保护素水平明显低于对照组，4岁前处于上升趋势，但从4-10岁CF儿童钙保护素水平就高于对照组。这表明钙保护素在年龄较大的儿童中作为CF肠道炎症标志物有潜在的用途。

4、CF的治疗

对于CF的治疗以前更注重改变临床症状和体征，但随着CFTR基因的研究，针对CFTR基因治疗给患者带来了新的希望。目前治疗CF的方法主要包括：黏液溶解剂、抗生素、基因治疗或药物增加CFTR功能[5]。因此针对CFTR基因治疗的药物增效剂（vacaftor，即 VX-770）和纠正剂（Lumacaftor）陆续出现，不管是单联还是双联CFTR调节剂疗法均能有效改善CF的病情，降低发病率，提高生存率[21]。

VX-770主要针对CFTRⅢ类突变，增加细胞表面CFTR通道开放的可能性[22]。VX-770是进入人类临床试验的第一个有效的口服CFTR增效剂。Needham等[23]人对16名CF患者进行静脉滴注增效剂六个月后观察前后肠道微生物群落和炎症标志物的变化，发现粪便钙保护素水平降低，肠杆菌科细菌丰度减少，Akkermansia的丰度增加。因此，CFTR增效剂可以充分改善CF肠道环境，从而有利于更健康的微生物区系，减少肠道炎症。通过一系列的研究发现VX-770仅对G551D突变的CFTR有效，但是G551D突变的发生仅占CF患者中的4%-5%[24]。因此随后又研究出针对CFTRⅡ类突变的纠正剂VX-809，可以改善phe508 del CFTR到细胞表面的加工和传送[22]。

 VX-809是在F508del-CFTR的生物发生和内质网加工过程中促进F508del-CFTR部分的正确折叠，使其能够离开内质网，运输到细菌表面，并正常发挥功能[25]。VX-809还被称为结构导向矫正器，它可以纠正主要破坏NBD1-MSD1/2界面稳定的错义突变[26]。获得美国FDA批准的Orkambi（ivacaftor/lumacaftor）复方药，可以治疗6岁以上CFTR基因F508del纯合突变CF患者；同时获批的Trikafta（elexacaftor/ivacaftor/tezacaftor）三联疗法主要治疗12岁及以上至少携带一个F508del基因突变的CF患者[27]。虽然CFTR 基因治疗在CF患者治疗中获得了重大进展，但面对临床应用仍存在挑战。首先，CFTR基因突变的多样性，已知的突变种类就有2000种，更多罕见的突变类型未找到相应的治疗。其次，有研究指出，许多即使符合条件的突变患者，仍未达到预期效果。因此，CFTR除对症治疗及基因治疗之外，还需要开展其他辅助疗法的研究。[29] 

有研究证明，服用益生菌制剂可以通过改善肠道屏障功能和调节免疫反应进而减轻肺部恶化的程度[28]。益生菌在肠道内的大量繁衍,定植在肠道可以直接或间接的对氯离子通道蛋白的表达和活性产生影响，调节紊乱的肠道菌群结构并提高机体的免疫能力,减少并发症。Bruzzese等[30]人对服用乳酸杆菌GG治疗4周后的CF患者及其对照组进行粪便钙保护素和直肠NO的测定，发现4周后粪便钙保护素和NO水平都明显下降。另一个相似的研究证明，与先给予口服安慰剂治疗组相比，先给予乳酸杆菌GG治疗的CF患儿的肺恶化程度和住院人数都明显降低[30]，由此可以看出益生菌可以减轻肠炎症，并且延缓呼吸损伤。

5、展望

CF在我国虽然有着很低的发病率，但是其死亡率很高。随着对CF发病机制的深入研究，已经证明CF会引起一系列胃肠道症状，并且CF患者会表现出不同程度的肠道菌群失调，但是肠道群落多样性减少和患者年龄增加与肺部疾病之间的关系需要更好的阐明。现在很多研究是针对CF患者细菌微生态失调的研究，在未来的研究中我们需要关注更广泛的微生物群落，包括对真菌和病毒的研究。针对CFTR蛋白缺陷的基因疗法的研究有很多，但CFTR基因突变的多样性，仍是下一步研究要考虑的。近期有研究证明益生菌制剂对CF患者的治疗有一定疗效，但还需要深入研究益生菌制剂对CF治疗的效果及其对治疗肠道炎症和细菌失调方面的作用。 

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基金项目：黑龙江省自然科学基金（LH2020H003）； 国家重点专科建设项目（GJ202302）

作者简介：邱志宇（1989-），女，汉族，黑龙江省佳木斯人，在读硕士研究生，从事肠道菌群研究.

通信作者： 吴庆田（1974-），男，教授，硕士研究生导师，从事肠道菌群研究.