止痒1号颗粒质量标准的提升研究

【摘要】 目的：制定止痒1号颗粒的质量标准。方法 对处方中多味饮片进行薄层色谱鉴别研究，建立苦参、黄柏及防风等3味饮片的薄层色谱鉴别方法，采用高效液相色谱法以黄芩苷为指标成分建立含量测定方法，对10批止痒1号颗粒进行定性定量检测。结果  薄层色谱斑点清晰，分离度好；黄芩苷在的范围内与峰面积呈良好的线性。黄芩苷的平均回收率为98.5%，RSD为1.2%（n=6）。10批样品中黄芩苷的含量为20.30mgg-1~23.93 mg.g-1。结论 建立的方法专属性强，耐用性好，灵敏度高，适合样品的质量分析。质量标准体系的建立为应用传统工艺配制的中药制剂提供质量保证，确保临床用药的安全有效。

【关键词】 止痒1号颗粒；医院制剂；质量标准；薄层鉴别；黄芩苷

Study on Improvement of Quality Standard of  Zhiyang No.1 Granules

WANG Dandan1,TONG Juhua2,Xu Qiang2,TAO Min*1,HUANG Qiaoling*1

(1Hangzhou Third People's Hospital,Hangzhou Zhejiang ,310009 China;2 Zhejiang Research Institute of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou Zhejiang 310023 China)

【Abstract】Objective To establish the quality standard for Zhiyang No.1 Granules.Methods  Thin-layer chromatography (TLC) identification was performed for multiple herbal pieces in the prescription, establishing TLC methods for Sophora flavescens, Phellodendron chinense, and Saposhnikovia divaricata. A high-performance liquid chromatography (HPLC) method was developed using baicalin as the marker compound for content determination. Qualitative and quantitative analyses were conducted on 10 batches of Zhiyang No.1 Granules.Results TLC spots showed clear resolution with good separation. Baicalin demonstrated excellent linearity within the range of 0.110~2.085 μg·mL-¹ (r = 1.0000). The average recovery rate of baicalin was 98.5% with an RSD of 1.2% (n = 6). The baicalin content in the 10 batches ranged from 20.30 mg·g-¹ to 23.93 mg·g-¹.Conclusion    The established methods are specific, robust, well-resolved, and highly sensitive, suitable for quality analysis of the samples. The quality standard system provides assurance for the quality of traditional Chinese medicine preparations prepared using conventional techniques, ensuring clinical safety and efficacy.

【Key words】 Zhiyang No.1 Granules; Hospital preparation; Quality standard; TLC identification; Baicalin

皮肤瘙痒症（Pruritus）是一种无明显原发性皮肤损害而以瘙痒为主要症状的皮肤病。中医称之为“风瘙痒”，历代中医文献根据不同皮损及发病部位有不同名称，如“痒风”“阴痒”等，现统称之为风瘙痒。《外科证治全书·痒风》记载“遍身瘙痒，并无疥疮，搔之不止”。中医分型为风热血热证、湿热内蕴证和血虚风燥证等证。主要以祛风止痒为原则。皮肤瘙痒症病程缠绵难愈，严重影响患者的生活质量[1-5]。虽然临床上西医常用的抗组胺药、激素类以及镇静类药物具有一定的效果，但长期使用可引发诸多不良反应[6-9]。

我院临床医生在长期诊疗过程中积累了丰富的皮肤瘙痒症治疗经验。止痒1号颗粒在我院协定方基础上进行进一步开发，具有疏风止痒，清热泻火之功效，适用于急性风湿热毒外袭的瘙痒性皮肤病，包括湿疹样皮炎、急性荨麻疹、药物性皮炎等，表现为急性瘙痒，可合并有舌红、苔黄、咽痛，皮疹糜烂、渗出等症者。

经十余年临床验证，对皮肤瘙痒症疗效确切。该制剂由12味中药精妙配伍而成[9-16]：其中，荆芥祛风、解表、透疹；防风祛风、解表；二药协同为用，以祛风解表见长，共为君药。石膏清热泻火；蝉衣（蝉蜕）开腠理、疏散风热、透表止痒；苦参、黄芩、黄柏均可利湿解毒；共为臣药。连翘透邪解毒；升麻发表透疹，清热解毒；白藓皮、地肤子为皮科祛风止痒常用药对，功擅清热燥湿，祛风止痒；合为佐药。甘草调和诸药为使。全方共奏祛风清热，利湿解毒之功。本研究通过建立该制剂的质量标准体系，为保障其临床疗效的稳定性和可重复性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1260高效液相色谱系统(美国安捷伦公司) ； XS105电子分析天平、ME204-E电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-500VDE型三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

黄芩苷（批号：110715-202122，纯度：94.2%）、氧化苦参碱（批号：110713-202015，纯度：85.9%）、盐酸小檗碱（批号：110780-201909，纯度：92.9%）及升麻素苷（批号：111522-202214，纯度：95.7%），对照品均购自于中国食品药品检定研究院，乙腈、甲醇为色谱纯（默克，纯度均≥99.9%）；三氯甲烷、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、氨水、甲酸、冰醋酸及磷酸等均为分析纯，均购自于成都市科隆化学品有限公司；水为超纯水，10批止痒1号颗粒样品、缺黄芩阴性样品、缺黄柏、缺苦参及缺防风阴性样品均根据工艺制备。

1.2 方法

1.2.1 苦参薄层鉴别研究

1.2.1.1供试品溶液的制备

取本品10g，加氨水0.5mL润湿，加入三氯甲烷30mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1mL溶解，作为供试品溶液。

1.2.1.2对照品溶液的制备

取氧化苦参碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.1.3缺苦参阴性对照溶液的制备

取缺苦参的止痒1号颗粒10g，照供试品溶液制备方法制成缺苦参阴性供试品溶液。

1.2.1.4色谱条件

照2020年版《中国药典(四部)》薄层色谱法试验[17]，吸取供试品溶液10μL、对照品溶液10μL，分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-氨水（8∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，立即检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

1.2.1.5 点样量选择及专属性试验

分别取缺苦参阴性对照溶液10μL、对照品溶液10μL、供试品溶液5、10、15μL，分别点于同一用2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以“2.1.4”项下色谱条件展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，立即检视。

1.2.1.6 验证试验

取三批供试品溶液，按上述色谱条件展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液，立即检视。

1.2.2 黄柏薄层鉴别研究

1.2.2.1供试品溶液的制备

取本品1g，加甲醇20mL，超声提取10min，滤过，滤液作为供试品溶液。

1.2.2.2对照品溶液的制备

取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.2.3缺黄柏阴性对照溶液的制备

取缺黄柏的止痒1号颗粒1g，照上述供试品溶液制备方法制成缺黄柏阴性供试品溶液。

1.2.2.4色谱条件

照2020年版《中国药典(四部)》薄层色谱法试验[17]，吸取供试品溶液1μL、对照品溶液1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰乙酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

1.2.2.5点样量选择及专属性试验

分别取缺黄柏阴性对照溶液1μL、对照品溶液1μL、供试品溶液1、2、3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以上述色谱条件展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。

1.2.2.6验证试验

取三批供试品溶液，按“上述色谱条件展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。

1.2.3 防风薄层鉴别研究

1.2.3.1供试品溶液的制备

取本品2g，加甲醇20mL，超声提取30min，滤过，滤液蒸至近干，拌入1g中性氧化铝，拌匀，水浴干燥，加在中性氧化铝柱（直径1cm，2g）上，用乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为供试品溶液。

1.2.3.2对照品溶液的制备

取升麻素苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.3.3缺黄柏阴性对照溶液的制备

取缺防风的止痒1号颗粒2g，照上述供试品制备方法制成缺防风阴性供试品溶液。

1.2.3.4色谱条件

照2020年版《中国药典(四部)》薄层色谱法试验[17]，分别吸取供试品溶液1μL、升麻素苷对照品溶液1μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-冰乙酸-甲酸-水（10∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外灯（365nm）下检视。

1.2.3.5点样量选择及专属性试验

分别取缺防风阴性对照溶液2μL、升麻素苷对照品溶液2μL、供试品溶液1、2、3μL，点于同一硅胶G薄层板上，以上述色谱条件展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外灯（365nm）下检视。

1.2.3.6验证试验

取三批供试品溶液，按“2.3.4”项下色谱条件展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。

1.2.4 定量研究

1.2.4.1色谱条件与系统适应性试验

色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱；以甲醇-0.2%磷酸溶液（41：59）为流动相等度洗脱，柱温30℃，流速1.0mL.min-1，检测波长280nm，进样量10μL，理论塔板数按黄芩苷峰计算不少于3000。

1.2.4.2对照品溶液配制

取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，再用70%甲醇稀释，制成每1ml含90μg的溶液，即得。

1.2.4.3供试品溶液制备

取止痒1号颗粒，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50ml，称定重量，超声处理（功率300W，频率45kHz）20分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取缺黄芩的阴性样品约0.2g，照上述对照品溶液配制方法制备，制成缺黄芩阴性对照溶液。

1.2.4.4专属性试验

按上述色谱条件，精密吸取空白溶液、缺黄芩的阴性对照溶液、黄芩苷对照品溶液及止痒1号颗粒供试品溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，得到相应的色谱图。

1.2.4.5方法学考察

1）标准曲线的制备 

取黄芩苷对照品，分别配制至少5个浓度点，考察线性相关性。精密称取黄芩苷（纯度94.2%）对照品29.13mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.2744mg/mL的黄芩苷对照品储备液。分别精密吸取上述对照品储备液适量，即得L1～L7线性对照溶液。照上述色谱条件，分别精密吸取上述不同浓度的L1～L7线性溶液各10µL，注入液相色谱仪进样分析，记录各个浓度黄芩苷的色谱峰面积。以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性相关系数。

2）精密度试验 

精密吸取同一对照品溶液，在上述色谱条件下进样测定，连续进样5次，记录峰面积。

3）重复性试验  

照上述方法平行制备供试品溶液6份，分别精密吸取对照品溶液和上述供试品溶液各10mL，注入液相色谱仪进样分析，记录供试品溶液和对照品溶液中黄芩苷的色谱峰面积。按外标两点法对数方程计算，以峰面积计算6份供试品的黄芩苷含量测定结果，报告平均值及RSD值。

4）中间精密度试验  

由不同人员在不同日期使用不同仪器，按照上述方法，平行制备供试品溶液。同供试品溶液制备方法制备缺黄芩阴性供试品溶液。按照上述色谱条件，分别精密吸取上述对照品溶液和上述供试品溶液各10mL，注入液相色谱仪进样分析，记录供试品溶液和对照品溶液中黄芩苷的色谱峰面积。按外标两点法对数方程计算，以峰面积计算6份供试品溶液中黄芩苷含量测定结果，报告平均值及RSD值，比较重复性和中间精密度的测定结果，报告12份供试品含量测定结果的平均值及RSD值。

5）加样回收率试验 

按上述方法，取供试品取样量的1/2（约0.1g），精密加入浓度为0.2744mg/mL的黄芩苷对照品溶液7.5mL，分别制备100%浓度水平的加样回收供试品溶液，平行制备6份。按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和上述6份加样回收供试品溶液各10mL，注入液相色谱仪进样分析，记录供试品溶液和对照品溶液中黄芩苷的色谱峰面积。按外标两点法对数方程计算，以峰面积计算6份供试品回收率，报告平均值及RSD值。

6）溶液稳定性试验

按照上述方法，制备供试品溶液1份，室温放置，在0～32小时内的进样次数不少于5次，考察其稳定性。

按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和上述供试品溶液各10mL，注入液相色谱仪进样分析，记录供试品溶液和对照品溶液中黄芩苷的色谱峰面积，并计算与0时含量的RSD值。

7）含量测定结果

取10批止痒1号颗粒的样品，按上述方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件分别进样测定。

2 结果

2.1 苦参薄层鉴别研究

2.1.1 点样量选择

点样量实验，发现供试品溶液点样量为10μL，斑点较为清晰，展开效果较好，故最终供试品点样量为10μL，见图1。

图1  苦参点样量薄层色谱图

1-缺苦参阴性样品溶液；   2，3，4-供试品溶液； 5-氧化苦参碱对照品

2.1.2验证试验

三批供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。经验证认为该薄层色谱鉴别方法可对止痒1号颗粒进行质量控制，故列入内控制剂标准中，见图2。

图2  苦参薄层色谱图

3，供试品溶液， 4-氧化苦参碱对照品

2.2 黄柏薄层鉴别研究

2.2.1 点样量选择

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。且阴性样品无干扰，见图3。经实验发现，供试品溶液点样量为1μL，斑点较为清晰，展开效果较好，故最终供试品点样量为1μL。

图3  黄柏点样量薄层色谱图

1-缺黄柏阴性样品溶液；  2，3，4-供试品溶液； 5-盐酸小檗碱对照品

2.2.2验证试验

由图可知：三批供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。经验证认为该薄层色谱鉴别方法可对止痒1号颗粒进行质量控制，故列入内控制剂标准中。见图4。

图4  黄柏薄层色谱图

1- 3，供试品溶液；4-盐酸小檗碱对照品

2.3防风薄层鉴别研究

2.3.1 点样量选择

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。且阴性样品无干扰，见图5。经实验发现，供试品溶液点样量为1μL，斑点较为清晰，展开效果较好，故最终供试品点样量为1μL。

图5  防风点样量薄层色谱图

1-缺防风阴性样品溶液；2，3，4-供试品溶液；5-升麻素苷对照品

2.3.2验证试验

由图可知：三批供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。经验证认为该薄层色谱鉴别方法可对止痒1号颗粒进行质量控制，故列入内控制剂标准中，见图6。

图6  防风薄层色谱图

1- 3，供试品溶液， 4-升麻素苷对照品

2.4定量研究

2.4.1 专属性试验

结果显示，止痒1号颗粒供试品在与黄芩苷对照品相应的位置上有相同保留时间的色谱峰；而缺黄芩的阴性对照溶液在相同保留时间处无色谱峰，说明止痒1号颗粒中其他药味对黄芩苷的测定无干扰。该测定方法的专属性好，系统适用性符合要求，见图7。

图7高效液相色谱图

A-空白溶液；B-阴性对照溶液；C-对照品溶液；D-供试品溶液；

2.4.2 线性关系考察

结果表明：黄芩苷在0.110~2.085μg·mL-1内线性关系良好，回归方程Y=3694.8240X+6.0529，r=1.0000。

2.4.3 精密度试验 测得黄芩苷的峰面积RSD为0.1%，表明仪器的精密度良好。

2.4.4 重复性试验

结果表明：6份供试品溶液黄芩苷含量结果RSD值为0.5%，符合RSD≤2.0%的要求，表明方法的重复性良好。

2.4.5 中间精密度试验

结果表明：中间精密度与重复性的测定结果进行比较，RSD值为0.8%，符合RSD≤2.0%的要求。

2.4.6加样回收率试验

结果表明：加样回收供试品溶液的回收率为98.5%，RSD值为1.2%，符合回收率应在92%~105%之间、RSD≤2.0%的要求。见表1。

表1黄芩苷回收率的测定结果（n=6）

2.4.7  溶液稳定性试验

结果表明：以各时点含量与0时含量的RSD值均≤2.0%且以所有含量RSD值均≤3.0%的连续进样最长时间作为溶液稳定的最长时间，故黄芩苷对照品溶液有效期为32小时，供试品溶液有效期为32小时。

2.4.8   含量测定

由实验结果可知，10批止痒1号颗粒样品黄芩苷含量为20.30mg.g-1～23.93 mg.g-1，说明制剂的配制工艺基本稳定。见表2。

表2  样品含量测定结果

3讨论

3.1薄层色谱定性分析

中药的种类繁多，成分复杂，中药的真伪鉴定方法是否可靠关乎中药质量的有效控制和临床用药安全。薄层色谱法作为一种平面色谱技术，具有经济、灵活，高通量，直观等特点，被广泛用于多个领域的成分分离分析[18-21]。止痒1号颗粒中处方药味较多，成分复杂，干扰较大。除列入质量标准中的苦参、黄柏及防风，另对处方中其他药味进行了薄层色谱研究。分别对连翘、荆芥等药味进行了提取方法、展开剂及点样量的考察，但在与对照药材色谱相应的位置上，均没有检测到相同颜色的斑点，故未列入质量标准中。

另对苦参、黄柏及防风薄层鉴别方法进行了提取方法、点样量、展开系统等的比较研究，最终选取最优的提取条件及展开系统，另对耐用性进行了分析研究，结果表明，在不同固定相及不同温湿度环境下，供试品斑点均能达到较好分离。

3.2 定量研究

高效液相色谱法（HPLC）作为现代分析化学的关键技术，因其卓越的分离能力和高检测灵敏度，在药物含量应用广泛[22]。止痒1号颗粒所含的黄芩苷是该复方用于治疗风热型湿疹的主要有效成分之一，本实验采用HPLC对其定量考察。本实验方法学考察中对磷酸的浓度进行了研究，分别比较了0.1%磷酸、0.2%磷酸及0.4%磷酸等三种浓度，结果显示，以0.2%磷酸系统洗脱出的色谱峰峰型对称性较好，浓度适中，可延长色谱柱的使用寿命，故选择甲醇-0.2%磷酸作为洗脱溶剂。另通过适当改变色谱条件:不同品牌的色谱柱、柱温、不同液相色谱仪等耐用性试验进行考察研究，结果显示黄芩苷的耐用性较好，均能达到基线分离，纳入质量标准体系中。

另对处方中君药防风进行了定量研究，通过改变柱温、供试品的提取方法及流动相洗脱体系等大量的试验分析，升麻素苷色谱峰基线杂质较多，分离度差，不适合作为指标成分，故不纳入质量标准体系。

本研究建立的质量标准体系方法简单易操作，且灵敏度高，专属性强。处方药味饮片质量的优劣对医院制剂的临床效果起到了决定性作用，完善可靠的药学质量标准体系可更加全面有效的控制制剂质量，为患者用药保驾护航。中药复方制剂通过辨证论治用于治疗皮肤瘙痒症，效果显著，不良反应少，应用前景广泛，具有较高的研究价值。

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项目名称：杭州市生物医药和健康产业发展扶持科技专项(编号2021WJCY171）