七黄膏薄层及含量测定方法研究

目的：建立外用膏剂的薄层鉴别和含量测定方法，为外用膏剂七黄膏的质量控制提供科学、可靠依据。方法：对外用膏剂中黄连、三七进行TLC鉴别；同时，采用HPLC测定外用膏剂黄连中盐酸小檗碱的含量、外用膏剂三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量，并进行方法学考察。结果：黄连、三七的TLC鉴别斑点清晰且专属性良好，阴性对照无干扰；盐酸小檗碱在0.184685~1.84685μg（r=0.9993）范围内，峰面积与进样量之间存在着良好的线性关系；盐酸小檗碱的平均加样回收率为105.51%，RSD为0.093%。结论：建立的外用膏剂的薄层鉴别、含量测定方法简便合理、准确，稳定可行，可为质量标准研究提供可靠依据，对于保障临床用药的安全性和有效性具有重要意义。

七黄膏是院内临方制剂，主要用于痔疮、肛瘘等疾病，功能主治为清热解毒、消肿止痛、生肌止血。由于该制剂组分复杂，需通过TLC和HPLC对其有效成分进行薄层鉴别和含量测定，为质量标准研究提供可靠依据，对于保障临床用药的安全性和有效性具有重要意义。

2. 实验方法

2.1 实验材料与设备

实验仪器包括电热恒温水浴锅、超声波清洗机、薄层电动点样仪、LC-2030 Plus高效液相色谱仪等。实验材料包括七黄膏、黄连、三七等中药材，以及乙醇、甲醇等试剂和对照品。

2.2 外用膏剂的薄层鉴别方法

2.2.1 黄连的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取外用膏剂加入乙醇，加热融化后提取，滤过并蒸干，残渣加水溶解后用乙酸乙酯提取，蒸干后加甲醇溶解作为供试品溶液。对照品溶液和阴性对照溶液的制备方法类似。展开剂为正丁醇-冰醋酸-水(7:1:2)，检视条件为紫外光灯365nm下检视。

2.2.2三七的薄层鉴别

供试品溶液的制备：取外用膏剂加入乙醇，加热融化后提取，滤过并蒸干，残渣加水溶解，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取，取正丁醇提取液，用氨试液洗涤，去下层液，上层液加正丁醇饱和的水洗涤，正丁醇液浓缩至干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液。对照品溶液和阴性对照溶液的制备方法类似。展开剂为：三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)10℃以下放置分层的下层溶液，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显示清晰

2.3 外用膏剂的含量测定方法

2.3.1 黄连的含量测定

色谱条件与系统适用性实验：采用WondaSil C18 Superb色谱柱，流动相为乙腈-0.1%磷酸（50:50），检测波长为265nm。供试品溶液的制备方法同TLC鉴别部分。对照品溶液的制备采用盐酸小檗碱对照品。

2.3.2外用膏剂黄连的含量测定方法学验证

（1）专属性考察

精密吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按照2.3.1 项下色谱条件进行测定，记录色谱图。

（2）线性关系考察

取2.3.1 项下的盐酸小檗碱对照品溶液，分别精密吸取2μL、4μL、8μL、10μL、15μL、20μL进样，以峰面积值为纵坐标，加入量(μg)为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归分析。

（3）日间稳定性考察

精密吸取同一外用膏剂供试品溶液，在0h、2h、4h、6h、24h等不同时间点测定盐酸小檗碱的峰面积，考察其稳定性。

（4）精密度考察

精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，共6次，最后记录盐酸小檗碱的峰面积值，考察仪器精密度。

（5） 重现性考察

按照2.3.1项下方法重复制备6份供试品溶液，分别进样10μL，测定6份样品中盐酸小檗碱的含量，计算RSD值，考察其重现性。

 （6）加样回收率试验

精密称取已知含量同一批样品，取本品1.5g，共5份精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入浓度为0.0974mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液25ml，按3.1.2项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，测定含量，计算平均回收率。

3. 实验结果

3.1 黄连的TLC鉴别结果

3.1.1 专属性考察结果

外用膏剂黄连的TLC鉴别：由图1可知，外用膏剂供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺黄连的阴性供试品色谱在与相同的位置上无相应斑点，且阴性对照无干扰。

1、2：供试品；3、4：盐酸小檗碱对照品；5、6：黄连对照药材；7：阴性供试品

图1 外用膏剂黄连TLC专属性考察结果

3.1.2 不同厂家薄层板的考察结果

外用膏剂黄连的不同厂家薄层板的考察结果见图2，在3个不同厂家的硅胶G薄层板上供试品色谱与盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上，均显示相同的斑点。

①黄海板                             ② Merck 板                           ③青岛海洋板

1、2：供试品；3、4：盐酸小檗碱对照品；5、6：黄连对照药材；7：阴性供试品

图2 外用膏剂黄连TLC不同厂家薄层板的考察结果

3.2外用膏剂中三七的薄层鉴别结果

3.2.1 专属性考察结果

外用膏剂三七薄层鉴别：外用膏剂供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺三七的阴性供试品色谱在与相同的位置上无相应斑点，且阴性对照无干扰。图3

1、2、3：供试品；4、5：三七混标对照品；6、7：阴性供试品

图3  外用膏剂三七TLC专属性考察结果

3.2.2 不同厂家薄层板的考察结果

    外用膏剂三七的不同厂家薄层板的考察结果见图4，在3个不同厂家的硅胶G薄层板上供试品色谱与三七混标对照品色谱相应的位置上，均显示相同的斑点。

1、2、3：供试品；4、5：三七混标对照品； 6、7：阴性供试品

1：供试品；2：三七混标对照品；3：阴性供试品

图4 外用膏剂三七TLC不同厂家薄层板的考察结果

3.3 黄连的含量测定结果

专属性考察结果显示，盐酸小檗碱的保留时间为7.149min，阴性供试品对测定无干扰。线性关系考察结果显示，盐酸小檗碱在0.184685~1.84685μg范围内与其色谱峰面积呈良好的线性关系。日间稳定性、精密度、重现性及加样回收率考察结果均符合要求。

3.3.1 专属性考察结果

专属性考察结果见图5、6、7，盐酸小檗碱的保留时间为7.149min，阴性供试品对测定无干扰，结果表明专属性良好。

图5 外用膏剂黄连供试品色谱图

图6 小檗碱对照品色谱图

图7 阴性供试品色谱图

4.3.2 线性关系考察结果

通过线性关系分析得到回归方程：y=5E+06X+286105，R2=0.9993。结果表明，盐酸小檗碱在0.184685~1.84685μg范围内与其色谱峰面积呈良好的线性关系，见表1，回归曲线如图8。

表1 对照品加入量及峰面积

     图8 盐酸小檗碱标准曲线

4.3.3 日间稳定性考察结果

在0h、2h、4h、6h和24h等不同时间点进行测定，结果显示，在24h内，盐酸小檗碱RSD值为0.055%，符合要求，表明样品溶液在24h内稳定。见表2。

表2 日间稳定性考察结果

4.3.4 精密度考察结果

盐酸小檗碱的RSD值为0.032%(n=6)，表明方法、仪器的精密度良好。见表3。

表3 精密度考察结果

4.3.5 重现性考察结果

6份供试品的平均含量为1.564mg/g，RSD（n=6）为0.22%，表明样品的重现性良好。见表4。

表4 重现性考察结果

4.3.6 加样回收率试验结果

通过测定盐酸小檗碱的峰面积，计算平均回收率，结果见表5，盐酸小檗碱的平均回收率为105.51%，RSD为0.093%(n=5)，表明该方法准确可信。

表5 加样回收率试验结果

4. 结论与讨论

4.1 结论

本研究建立的外用膏剂中黄连的薄层色谱鉴定方法及含量测定HPLC分析方法简便可靠、结果准确、专属性良好，适用于外用膏剂的质量控制。

4.2 讨论

本制剂成分复杂，样品前处理尤为重要。通过查阅药典和相关文献，优化了前处理方法，避免了基质对有效成分提取的干扰。实验过程中发现，柱温对三七皂苷的测定影响较大，需严格控制实验条件。未来需进一步改进实验方法和操作过程，提高数据准确性。

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