高效液相色谱法建立三七总皂苷提取物中5种皂苷成分的定量分析方法及指纹图谱

摘要：目的 探究高效液相色谱（HPLC）技术在三七总皂苷提取物中5种皂苷（Rg1、Rb1、Rd、R1、Re）定量及指纹图谱构建中的应用，明确其质量控制价值。方法：以10批不同来源提取物为对象，用C18柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长203nm，进样量10μL；制备对照品与供试品溶液，通过线性、精密度等试验验证定量方法，构建指纹图谱并计算相似度、标定特征峰。结果：5种皂苷线性关系良好（R²≥0.9995），精密度、稳定性、重复性RSD分别＜1.0%、1.5%、2.0%，加样回收率96.5%~103.2%；指纹图谱标21个共有峰，10批样品相似度≥0.95，含量测定稳定。结论：该HPLC方法可实现5种皂苷精准定量与整体质量评价，保障提取物质量稳定一致，为相关产品研发、生产及监管提供技术支撑，具推广价值。

关键词:高效液相色谱法；三七总皂苷提取物；皂苷成分；定量分析；指纹图谱；质量控制

三七作为我国传统名贵中药材，干燥根及根茎具散瘀止血、消肿定痛效能，在心血管疾病治疗、跌打损伤修复等领域应用广泛，其核心活性成分为三七总皂苷，其中人参皂苷Rg1、Rb1、Rd及三七皂苷R1、Re等单体含量与比例，直接决定提取物药理活性与临床疗效[1-3]。当前三七总皂苷提取物已开发为注射剂、片剂等多种剂型临床使用，但因原料产地、采收期差异及生产企业提取纯化工艺不同，市场产品质量参差，部分存在有效成分不足、杂质超标甚至掺假问题，影响疗效且引发用药安全风险[4-5]。传统质量评价多聚焦1-2种主要皂苷定量，难以全面反映成分组成特征，无法满足现代中药质量监管精细化需求。高效液相色谱（HPLC）技术分离效率高、定量准确，指纹图谱可直观呈现成分分布规律，二者结合形成“精准定量+整体表征”评价体系，却因现有研究覆盖成分少、特征峰标定不全、二者结合不足等问题限制应用，故本研究以5种关键皂苷为对象，优化HPLC条件建立定量方法与特征指纹图谱，为质量标准制定、生产监控及用药安全提供依据，推动产业规范化发展。

1资料与方法

1.1一般资料

选用10批不同来源三七总皂苷提取物，涵盖云南文山、广西百色等核心产区及5家不同规模企业，生产批次2023年1-12月，均符合《中国药典》（2020年版）基础要求，外观为浅黄色至黄棕色粉末、无异味及吸潮结块，附带完整生产工艺与原料信息。试剂方面，人参皂苷Rg1、Rb1、Rd、Re及三七皂苷R1对照品（纯度≥98.0%，批号各异）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，德国默克）、磷酸（分析纯，国药集团）、超纯水（电阻率≥18.2MΩ・cm）用于分析。仪器含Agilent 1260高效液相色谱仪、ME204E电子天平、KQ-500DE超声波清洗器、Waters C18固相萃取柱、RE-52AA旋转蒸发仪及0.45μm有机相滤膜，满足实验各环节需求。

1.2方法

采用C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）为固定相，其对皂苷类成分分离效能优异；以乙腈（A相）-0.1%磷酸水溶液（B相）执行梯度洗脱，程序为0~10min 15%A→20%A、10~25min 20%A→30%A、25~40min 30%A→45%A、40~50min 45%A→15%A，后续平衡5min实现5种皂苷与杂质分离，流速1.0mL/min，柱温经柱温箱调控至30℃保障峰形与分离度，检测波长203nm（全波长扫描确认吸收稳定、干扰少），进样量10μL，进样前用流动相平衡柱体30min，基线噪音≤0.01mAU时启动分析。

对照品储备液为精密称取各目标皂苷10mg置10mL容量瓶，甲醇溶解定容摇匀，浓度1.0mg/mL，4℃避光保存且有效期1个月；混合对照品溶液为精密量取单一储备液0.2~1.5mL置7个10mL容量瓶，甲醇定容摇匀得系列浓度，用于线性考察；供试品溶液为精密称取提取物0.1g置50mL容量瓶，加甲醇40mL超声处理（500W、40kHz）30min，放冷定容摇匀，经0.45μm滤膜过滤后过C18柱纯化（5mL甲醇活化、5mL水平衡、加样液、甲醇洗脱），收集洗脱液浓缩至近干，甲醇定容至10mL摇匀，需现配现用防降解。

方法学验证中，线性关系通过系列混合对照品进样，以浓度（μg/mL）为X、峰面积为Y绘标准曲线算回归方程及R²（≥0.9990）；精密度取0.1mg/mL混合对照品连续进样6次算峰面积RSD（＜2.0%）；稳定性取同一供试品溶液0~24h进样算RSD（＜2.0%）；重复性取同批次样品制6份供试品算含量RSD（＜2.0%）；加样回收率取已知含量样品6份（0.05g/份），加80%、100%、120%比例对照品，处理后进样算回收率（95%~105%）及RSD（＜2.0%）。

指纹图谱构建取10批供试品进样得色谱图，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）峰匹配定共有特征峰并生成共有模式，计算相似度（≥0.90），标定目标皂苷对应峰并分析峰面积差异；样品含量测定取10批供试品进样，依标准曲线算5种皂苷含量（mg/g），比较波动范围评估质量一致性。

1.3观察指标

（1）方法学验证指标:包括5种皂苷成分的回归方程、相关系数（R²），用于判断线性关系好坏；5种皂苷成分峰面积的RSD，反映精密度情况；供试品溶液中5种皂苷成分峰面积在24h内的RSD，体现稳定性；6份供试品溶液中5种皂苷成分含量的RSD，评估重复性；5种皂苷成分的平均加样回收率及RSD，验证准确度。

（2）指纹图谱相关指标:涵盖共有特征峰数量及保留时间，明确指纹图谱的特征性；10批样品与共有模式的相似度值，判断不同批次样品的质量一致性；5种目标皂苷成分对应特征峰的峰面积占总峰面积的比例，了解目标成分在提取物中的相对含量水平。

（3）样品含量指标:包含10批三七总皂苷提取物中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、三七皂苷R1、人参皂苷Re的单独含量（mg/g）；5种皂苷成分的总含量（mg/g）及不同批次间的含量变异系数（CV），综合评估样品的含量稳定性与均一性。

1.4统计学分析

所有试验数据采用SPSS 26.0统计软件进行处理。计量资料以x̄±s表示，其中线性关系通过线性回归分析计算回归方程及R²；精密度、稳定性、重复性试验及加样回收率的RSD通过标准差公式计算；不同批次样品中5种皂苷成分的含量差异采用单因素方差分析（ANOVA），若差异有统计学意义（P<0.05），进一步采用LSD法进行多重比较；指纹图谱相似度通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）直接计算，无需额外统计分析。以P<0.05为差异具有统计学意义的标准。

2结果

2.1方法学验证结果

依据1.3中方法学验证指标的考察要求，对5种皂苷成分的线性关系、精密度、稳定性、重复性及加样回收率进行测定，结果如下表所示。由表可知，5种皂苷成分在各自浓度范围内线性关系良好（R²均≥0.9995），精密度试验相对标准偏差（RSD）均＜1.0%，稳定性试验（24h内）RSD均＜1.5%，重复性试验RSD均＜2.0%，加样回收率介于96.5%~103.2%（RSD＜2.0%），所有验证指标均符合《中国药典》（2020年版）中中药成分定量分析方法学验证的相关要求，表明本研究建立的HPLC定量分析方法准确、稳定、可靠，可用于三七总皂苷提取物中5种皂苷成分的定量测定。

表1 5种皂苷成分的方法学验证结果

注：表中加样回收率数据以“平均值±标准差”表示，RSD为相对标准偏差，n=6（精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验均平行进行6次）。

2.2指纹图谱相关结果

按照1.3中指纹图谱相关指标的考察内容，对10批三七总皂苷提取物进行HPLC分析，构建指纹图谱并开展相似度评价，结果如下表所示。由表可见，本研究构建的三七总皂苷提取物HPLC指纹图谱共标定21个共有特征峰，各共有特征峰的保留时间相对稳定，RSD均＜2.0%，表明指纹图谱的特征性良好；10批样品与共有模式的相似度均≥0.95，其中相似度最高为0.986，最低为0.952，均符合中药指纹图谱相似度≥0.90的评价标准，说明不同来源、不同生产批次的三七总皂苷提取物在整体化学成分组成上具有较高的一致性；同时，5种目标皂苷成分对应特征峰的峰面积占总峰面积的比例介于65.3%~72.8%，表明这5种皂苷成分是三七总皂苷提取物中的主要活性成分，进一步验证了本研究选择这5种成分作为定量分析对象的合理性。

表2 10批三七总皂苷提取物指纹图谱相关结果

注：共有特征峰保留时间RSD为21个共有特征峰保留时间的平均相对标准偏差，n=3（每批样品平行进样3次）；5种目标皂苷成分峰面积占比为5种成分对应特征峰峰面积之和与总峰面积的比值。

2.3样品含量测定结果

根据1.3中样品含量指标的考察要求，采用已验证的HPLC定量分析方法，对10批三七总皂苷提取物中5种皂苷成分的单独含量、总含量及不同批次间的含量变异系数（CV）进行测定，结果如下表所示。由表可知，10批样品中，人参皂苷Rg1含量介于12.56~15.87mg/g，人参皂苷Rb1含量介于10.23~13.65mg/g，人参皂苷Rd含量介于5.67~8.92mg/g，三七皂苷R1含量介于8.78~11.23mg/g，人参皂苷Re含量介于4.32~6.78mg/g；5种皂苷成分的总含量介于41.56~56.45mg/g，不同批次间总含量的变异系数（CV）为12.3%。经单因素方差分析（ANOVA）显示，不同批次样品中5种皂苷成分的含量存在显著差异（P=0.001＜0.05），进一步采用LSD法进行多重比较发现，主要差异来源于不同产地和不同生产企业的样品，其中云南文山产地、大型生产企业的样品中5种皂苷成分含量相对更高且更稳定，这可能与原料三七的品质及生产工艺的规范化程度有关。

表3 10批三七总皂苷提取物中5种皂苷成分含量测定结果（x̄±s，mg/g，n=3）

注：CV为变异系数，计算公式为（标准差/平均值）×100%；n=3表示每批样品平行制备3份供试品溶液并进行含量测定。

3讨论

本研究针对高效液相色谱法构建三七总皂苷提取物中5种皂苷成分定量分析方案及指纹图谱开展工作，依托方法学验证、指纹图谱构建与样品含量测定获取关键数据，结合统计学分析明晰方法实用性与样品质量特征。方法学验证结果显示，5种皂苷线性关系、精密度、稳定性、重复性及加样回收率均契合中药成分定量分析严苛标准，R²均≥0.9995体现极强线性相关性，精密度RSD均＜1.0%反映仪器检测高度稳定，24h内稳定性RSD＜1.5%说明供试品溶液在常规检测周期内成分无明显降解，加样回收率96.5%~103.2%且RSD＜2.0%证实方法准确，上述结果共同证明所建HPLC定量分析方案技术性能可靠，为后续样品含量测定提供科学支撑。

指纹图谱分析数据表明，10批样品共标定21个共有特征峰且各峰保留时间稳定，该特征图谱可全面反映提取物化学成分组成，为真伪鉴别提供直观依据。10批样品与共有模式相似度均≥0.95，远高于0.90评价阈值，即便样品来源覆盖不同产区与生产企业，整体化学成分分布仍保持较高一致性，所建指纹图谱可有效用于多批次提取物质量一致性评估，弥补传统单一成分定量分析无法反映整体质量的不足。

样品含量测定结果及统计学分析显示，不同批次提取物中5种皂苷含量存在显著差异（P=0.001＜0.05），此差异主要与原料产地及生产工艺相关，云南文山产地样品（如批次3、7）中5种皂苷含量普遍高于其他产地，大型生产企业样品含量波动更小，提示原料三七品质对提取物质量起关键作用，规范化生产工艺可降低含量差异。5种皂苷总含量变异系数为12.3%，虽有一定波动，但结合指纹图谱高相似度可知，该波动仍处合理范围，未对提取物整体质量特征产生显著影响。

综上所述，本研究建立的HPLC定量分析方案及指纹图谱实现“精准定量+整体表征”双重质量评价目标，既能准确测定5种关键皂苷含量，又可通过指纹图谱评价整体质量一致性。该方案为三七总皂苷提取物质量标准制定提供数据支撑，也为生产过程监控及临床用药安全保障提供可靠技术手段，对推动相关产业规范化发展具有重要意义。后续可扩大样品批次范围，结合更多活性成分分析，探索原料预处理、提取工艺优化对皂苷含量的影响，持续完善质量控制体系。

参考文献

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