测定利福平有关物质HPLC方法的建立及确证

摘要：高效液相色谱法由于分离效率高、灵敏度高、分析速度快、选择性好，常用于药物有关物质测定。建立合适的HPLC方法，可以分离和检测利福平及其有关物质，并对其定量分析。但目前有关利福平有关物质测定的HPLC方法，其专属性、灵敏度等方面还存在一定不足。为建立一种科学、正确和可靠的测定利福平有关物质的HPLC方法，全面确证该方法，以满足利福平质量控制的需要，为利福平药品的质量评价和监管提供技术依据。
关键词：利福平；HPLC；检测；确证
前言：利福平是一种常用抗结核药物，在结核病治疗中占有重要的地位。利福平对结核分枝杆菌有强大的杀菌作用，是治疗各种结核病的一线用药，积极治疗结核病对于减少结核病的传播和改善患者预后有重要的作用。但是在利福平生产、储存和使用过程中可能会产生多种有关物质，有关物质可能是由原料中的杂质、利福平合成过程中的副反应或异构化产物以及储存过程中的降解产物等产生的。有关物质的存在会带来利福平质量下降、影响药物的安全性和有效性等问题，有关物质可能存在一定的毒性，通过摄入利福平而带入人体，会影响人体的安全；有关物质可能会与利福平发生相互作用，改变利福平的药代动力学和药效动力学，从而影响药物的疗效。因此，对利福平中有关物质进行测定，对于保证药物质量、保证患者用药安全和提高药物疗效有重要的意义。
一、利福平概述

利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性。该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌 (包括麻风分枝杆菌等) 在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用利福平对需氧革兰阳性菌具良好抗菌作用，包括葡萄球菌产酶株及甲氧西林耐药株、肺炎链球菌、其他链球菌属、肠球菌属、李斯特菌属、炭疽杆菌、产气荚膜杆菌、白喉杆菌、厌氧球菌等。对需氧革兰阴性菌如脑膜炎奈瑟球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌亦具高度抗菌活性。利福平对军团菌属作用也很良好，对沙眼衣原体、性病淋巴肉芽肿及鹦鹉热等病原体均具抑制作用。细菌对利福霉素类抗生素有交叉耐药。利福平与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成，防止该酶与DNA连接，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止。。利福平口服吸收良好，服药后1.5～4小时血药浓度达峰值。利福平胶囊主要经胆和肠道排泄，可进入肠肝循环，但其去乙酰活性代谢物则无肠肝循环。60%～65%的给药量经粪便排出，6%～15%的药物以原形、15%为活性代谢物经尿排出，7%则以无活性的3-甲酰衍生物排出。亦可经乳汁排出。肾功能减退的患者中本品无积聚；由于自身诱导肝微粒体氧化酶的作用，在服用利福平的6～10天后其排泄率增加；用高剂量后由于胆道排泄达到饱和，本品的排泄可能延缓。

图1 利福平

二、HPLC方法概述

HPLC即高效液相色谱法，是现代分析化学中重要的用于分离分析的方法之一。它是根据不同物质在固定相和流动相中的分配系数不同分离物质的。HPLC系统由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据记录与处理系统等组成。高压输液泵以高压将流动相输送，进样器将样品准确地注入流动相中，样品被注入流动相中，随流动相进入柱形的固定相中，不同组分与固定相分配，即分离，分离后的各组分依次进入检测器，检测器把浓度信号转化为电信号，最后由数据记录与处理系统记录、处理[1]。

采用HPLC法进行利福平有关物质的测定有以下优点：（1）分离容易，利福平及其有关物质分离容易，能方便地同时测定利福平及其结构类似的有关物质。（2）灵敏度高。能测定出有关物质低到ng量级，在低含量的情况下，也能测得准确的结果，对药物质量控制非常有利。（3）所需时间短。能在短时间内测得结果。（4）定量准确。可以根据标准曲线得出有关物质的定量结果，而且精密度和准确度均能符合对药物质量的要求，可以对利福平质量进行评定。

三、测定利福平有关物质HPLC方法的建立

（一）利福平有关物质分离与鉴定的应用

利福平在生产、储存的过程中，会产生多种有关物质，这些有关物质结构与利福平的结构相似性大，分离困难。HPLC法分离效率高，可以比较容易的将利福平与其有关物质分离。通过选择合适的色谱柱、流动相、梯度洗脱程序，HPLC可以方便的将结构、性质不同的有关物质很好的分离出来。在此基础上，通过选择紫外、质谱等检测手段，可以对利福平的有关物质进行定性和结构鉴定。例如:利用质谱检测可以获得有关物质的分子量，通过与数据库比对或者结构进一步的拆解，确定有关物质的结构。这样可以弄清利福平的代谢途径、杂质的来源。这对药品的质量控制是有一定帮助的。同时对药品的安全性也会有一定的帮助，可以确定有关物质是否对人体有害[2]。

（二）利福平有关物质定量分析的应用

HPLC方法由于其高灵敏度和高精确度，被用来定量测定利福平有关物质。用HPLC方法测定利福平有关物质时，首先需要建立标准曲线，这样才能对利福平有关物质进行定量测定，建立标准曲线时，需要做好相关记录，保证曲线能够反应出浓度和响应值之间的关系。在进行测定的时候，实验条件的控制也非常重要，温度、流速、流动相组成不同，都会对结果有一定影响，分析时保证条件一致，才能保证方法的重复性和回收率。进行精密度测试时，同一样品多次进样，记录峰面积的RSD[3]。RSD小于2%时，说明方法精密度良好，重复性好。进行准确度测试时，通过加样回收实验来测试。在样品中加入一定量的有关物质对照品，进行测定，计算回收率，回收率在98%-102%时，说明方法能够测定出有关物质的真正含量。

（三）利福平生产过程质量监控的应用

用于利福平生产过程中的HPLC法可以实时跟踪有关物质的生成情况，有利于生产中的质量控制。在利福平生产的各反应合成步骤中，定时取样进行HPLC法检测，跟踪有关物质的生成情况(种类、含量等)。通过几个批次的分析，可以验证该生产工艺的重现性。如果发现有关物质的含量有异常升高的情况，可能表明在生产过程中存在一些问题，比如反应条件的不稳定、原料质量的不稳定等。通过及时调整生产条件或更换原料，可以减少有关物质的生成，提高药品质量。此外，HPLC法还可以用于成品的质量检查，可以科学的检验出利福平成品的质量。在药物储存和运输过程中，定时采用HPLC法检测有关物质的含量，可以跟踪药品稳定性，有利于科学的制定储存条件和有效期[4]。

四、测定利福平有关物质HPLC方法的确证

开展测定利福平有关物质HPLC方法的确证，科学、合理、严谨的证明该方法的科学性、准确性、可靠性，确保其能用于利福平药品的质量控制，是非常有必要的，确证方法应按照有关的规范和原则进行。

（1）专属性：取利福平对照品溶液、有关物质对照品溶液和空白溶剂分别适量，测定色谱图中各峰的分离情况，利福平峰与各有关物质峰之间，有关物质峰与有关物质峰之间应能良好分离，空白溶剂不产生干扰峰，证明本方法可以区分利福平及其有关物质。

（2）线性与范围：取利福平及有关物质对照品溶液，分别配制一系列不同浓度的标准溶液，进行测定，绘制标准曲线，计算线性回归方程和相关系数。相关系数应接近1，证明本方法于该浓度范围内线性关系好，能够正确判别浓度与峰面积或含量之间的关系[5]。

（3）精密度：可分为重复性和中间精密度。重复性系指同一分析人员在短时间内对同一份样品进行多次进样测定，计算峰面积或含量的相对标准偏差(rsd)；中间精密度系指不同分析人员、在不同时间、用不同仪器等进行测定，同样计算rsd。rsd应符合规定的要求，证明方法的精密度好，测定结果重复性好、稳定。

（4）准确度：配制一定浓度的供试品溶液，分别加入一定量有关物质对照品，测定回收率，回收率应在98%~102%之间，证明方法可以准确测定有关物质的含量。

（5）检测限和定量限：检测限系指样品中被测物能被检测出的最低量，证明方法的灵敏度。改变流动相组成、流速、柱温等条件，进行耐用性试验，证明方法的耐用性好。经过确证的HPLC方法，将为利福平药品的质量控制打下坚实的基础，为患者用药安全、有效保驾护航。

结束语：药品质量取决于制药质量，也取决于我们对药品质量要求的高低和广度。随着制药技术的进步和对药品质量要求的提高，我们将继续关注利福平有关物质研究的新进展，不断完善分析方法。可以进一步扩展该方法的应用范围，例如用于其他剂型利福平有关物质的测定；也可以对利福平中的有关物质进行结构鉴定或毒性研究。

参考文献

[1]张晓丽.抗结核分枝杆菌常用药利福平对生化检验测定结果的影响[J].中国医药指南,2021,19(14):124-125.DOI:10.15912/j.cnki.gocm.2021.14.057.

[2]朱思华,张玉昆,刘振先,等.分散固相萃取—超高效液相色谱—串联质谱法测定水产品中利福平残留[J].水产科学,2020,39(03):425-430.DOI:10.16378/j.cnki.1003-1111.2020.03.017.

[3]张瑞雨,师真,李文廷,等.UPLC-MS/MS同时测定结核患者体内异烟肼、利福平的浓度[J].中国药学杂志,2019,54(05):407-410.

[4]邱万铖,孙涛,李锋,等.HPLC-MS/MS测定人脑脊液中异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和利福平浓度[J].中国药学杂志,2018,53(14):1209-1215.

[5]章安源,李有志,张志民,等.高效液相色谱法测定6种兽用中药散剂中的利福平[J].中国兽药杂志,2018,52(05):42-48.