青海省1例KCNJ11基因变异致新生儿糖尿病的临床表现及遗传学分析

摘要：目的 探讨一例新生儿糖尿病的临床及基因变异特点，方法 收集患儿的临床资料，采集患儿及父母的外周血样，应用第二代测序技术，对患儿进行全外显子组测序分析，用Sanger测序验证候选变异及其家系来源。结果 患儿，男性，1月17天，主要表现为阵发性咳嗽，血糖偏高（随机血糖19.1mmol/l），胸片示支气管肺炎，心脏彩超示卵圆孔未闭。全外显子组测序发现患儿KCNJ11基因第1外显子存在一个杂合的错义变异c.481G>A (p.Ala161Thr)，该变异遗传自表型正常的父亲，确诊为KCNJ11变异导致的新生儿糖尿病，给予早9点、下午3点诺和灵R胰岛素0.5iu皮下注射，21点予以诺和灵N胰岛素1iu皮下注射控制血糖，血糖波动在9.8-16.1mmol/l，经治疗患儿病情好转。结论 确诊了1例KCNJ11变异导致的新生儿糖尿病患儿，从临床症状及分子层面为新生儿糖尿病的早期诊断提供依据。

关键词：KCNJ11基因  新生儿糖尿病  全外显子测定

新生儿糖尿病（NDM）是指出生后6个月内发生的糖尿病，通常需要胰岛素治疗，可分为永久性新生儿糖尿病（PNDM）和暂时性新生儿糖尿病（TNDM）。近年来，对NDM的发病涉及众多的基因，研究显示大多数的NDM属于单基因病，基因突变造成胰岛B细胞功能和成熟的缺陷，其中KATP通道编码基因突变是PNDM的主要病因。编码胰岛B细胞ATP-敏感性钾通道（KATP）Kir6.2和SUR1亚单位的KCNJ11和ABCC8基因突变占绝对多数。本报道通过家系全外显子组测序，确诊1例KCNJ11基因变异所致NDM的患儿。

1方法

1.1全外显子组测序

征得父母及患儿的知情与同意后按标准签署知情同意书，从患儿及父母静脉血中抽取抗凝血各3ml，对患儿及其父母共三人基因执行Trio全外显子组测序（whole exome sequencing,WES）。Trio-WES运用的全外显子捕获芯片为IDT ThexGenExome Research Panel v1.0，经IlluminaNovaSeq 6000系列测序仪（PE150）测序完成；目标序列测序覆盖度不低于99%。对测序原始数据进行筛选，通过质量控制(Quality Control,QC)过滤低质量reads后，采用BWA软件与参考人类基因组进行序列比对。排除重复读操作，对剩余读操作进行统计分析，采用GATK软件调用变量。基于ClinVar、HGMD、gnomAD、外显子组测序项目(ExomeSequencing Project)和1000 Genomes Project等公共突数据库和群体频率数据库对检测变异进行生物信息学注释，并根据数据库的资料预测其有致病或有害影响。采用汇集分子生物学注释、生物学、遗传学和临床特征分析为一体的遗传病精准诊断云平台系统分析筛选，结合正常人基因组数据库、致病突变数据库、已知四千种遗传病临床特征数据库等及基因数据库的并行分析算法，对数十万基因变异进行分级，变异分级主要参考三要素分级体系和2015年《ACMG遗传变异分类标准与指南》基因变异分级体系。

1.2 Sanger测序验证

根据NGS的检测结果，基于患儿及其父母的DNA标本进行Sanger测序。对检测到的目标序列进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增，使用ABI3730测序仪进行Sanger测序验证，并经序列分析软件SeqMan得到验证结果[1]。PCR扩增：首先进行预变性，94℃，5 min；变性30 s（94℃），退火30 s（60℃），链延伸1 min（72℃），再扩增30个循环，最终在72℃条件下补充延伸10 min。

2结果

2.1患儿主要临床特征表现为新生儿期不明原因的高血糖

患儿男，1月6天，土族，居住海拔2500米，因“发热、拒乳、呕吐2天，抽搐1次”为主诉就诊于青海省妇女儿童医院重症医学科，患儿系G2P2足月顺产，出生体重2800g。生后第34天不慎受凉后出现发热，触体发烫，具体体温未测，伴拒乳、呕吐2次，呈喷射性呕吐，呕吐物为胃内容物，无胆汁及咖啡样物质，哭闹明显，无咳嗽，无惊厥、抽搐，无腹胀及腹泻，测体温39.5℃，予以某医院住院输液治疗6小时余（具体诊疗经过不详），上述症状未见好转，静点过程中出现抽搐发作1次，表现为双眼上翻、四肢发紧、抖动，无口吐白沫，抽搐持续约1-2分钟后自行缓解。遂前往青海省妇女儿童医院就诊，入住重症医学科，入院检查结果符合糖尿病诊断，给予胰岛素0.5ml/h持续泵入下，血糖维持在6.0-8.0mmo1/L，行头颅CT示脑实质内未见明显异常;胸部CT示:肺炎;腹部彩超示:肝脏轻度肿大并回声略致密，脾、胰、双肾、输尿管、膀胱及肠管扫查未见明显异常。心脏彩超示:卵圆孔未闭；行腰椎穿刺，脑脊液常规检查:潘氏实验++、白细胞计数5×106/L。脑脊液生化:氯130.00mmol/1、葡萄糖4.49mmo/L脑脊液蛋白2.07g/L，考虑病毒性脑炎。诊断：（1）新生儿糖尿病；（2）糖尿病合并酮症酸中毒；（3）病毒性脑炎；（4）肺炎；（5）高乳酸血症；（6）卵圆孔未闭；（7）肾损伤。积极给予胰岛素0.5ml/h持续泵入控制血糖，及对症治疗，血糖维持在6.0-8.0mmo1/L，治疗2天。

后因患儿血糖仍偏高，咳嗽伴喉中痰响明显，再次入住青海省妇女儿童医院内分泌科，给予监测血糖，血糖波动范围4.7-18.89mmol/L，予以小剂量门冬胰岛素控制血糖，止咳对症治疗，查血气PH7.45、PaC02 39mmHg、Pa0279mmHg、cHC03-27.1mmo/L ABE3.1mmol/L;血常规示白细胞计数4.33×109/L、中性细胞比率22%、淋巴细胞比率54.7%、红细胞计数2.46×1012/L、血红蛋白浓度79g/L、血小板数目501×109/L、超敏C反应蛋白8.41mg/L、C-反应蛋白<10mg/L;血电解质正常；肾功六项:葡萄糖18.89mmol/L;心功七项:肌酸激酶同工酶25.8u/L、乳酸脱氢酶370.1u/ml、a-羟丁酸303u/1;血脂四项:甘油三酯1.88mmol/L;糖化血红蛋白HbA1C10%;促肾上腺激素66.52pg/ml;空腹胰岛素6.54uIU/ml，C-肽空腹1.38ng/ml;尿组合:葡萄糖+4.00mg/dl，酮体-mg/dl；行基因检测分析结果检测到KCNJ11基因的1个杂合变异，经对症治疗，血糖波动在4.3-16.4mmol/L，停小剂量胰岛素泵入，予以早9点应用诺和灵R胰岛素0.5iu皮下注射，下午3点应用诺和灵R胰岛素0.5iu皮下注射，21点予以诺和灵N胰岛liu皮下注射控制血糖，血糖波动在6.8-11.6mmol/L控制尚平稳，予以出院，院外继续胰岛素治疗，监测血糖波动在6.0-12mmol/L，无异常不适。

现患儿5月7天，体重8.5kg，身高67cm，抬头稳，纳乳可，要求住院复查，尿液分析及尿特种蛋白均在正常范围内;血化示电解质正常，肾功六项:葡萄糖7.93mmo1/L；胸片示支气管肺炎。腹部彩超示未见明显异常。心电图示：（1）窦性心动过速；（2）心电轴轻度右偏。头颅核磁示诊（1）脑实质内未见明显异常；（2）松果体区小囊状稍长T1信号影，考虑松果体囊肿；（3）双侧额、颞部脑外间隙增宽；（4）大枕大池;（5）双侧中耳乳突内见弥漫长T2信号。患儿父母系非近亲婚配，均体健，有一哥哥6岁，体健，家族中无类似患者。患儿主要表现为新生儿期不明原因的高血糖。

2.2基因检测结果及分析

患儿线粒体基因测序未见异常。进行全外显子组测序，鉴定出患儿携带KCNJ11:481G>A(p.Ala161Thr)的杂合错义变异。经过Sanger测序验证，该位点来自表型正常的父亲，母亲为野生型。根据ACMG评级，该位点为可能致病的(likely pathogenic，PM1+PM2+PP3+PP4)：该错义变异位于致病热点区或者位于CCR区域(PM1)；所有正常人群数据库频率小于0.0005(PM2)；两种统计方法预测出变异对基因(基因产物)有影响(PP3)；变异携带者的表型或家族史高度符合某种单基因遗传疾病(PP4)。KCNJ11编码一个跨膜蛋白，具有两个重要的功能结构域：内向整流钾通道跨膜域（IRK）和内向整流钾离子通道（IRK-C）。本次发现的变异位点p.Ala161Thr在IRK区域内。

3讨论

本次通过全外显子组测序鉴定出一例KCNJ11:481G>A(p.Ala161Thr)杂合变异所致的糖尿病患儿。Yorifuji等人(2005年)在一个4代家庭中发现了kcnj11基因(600937.0012)中的错义突变，该家庭的主要遗传糖尿病是3代(见610582)。糖尿病的发病和严重程度是不同的:一过性新生儿糖尿病(TNDM3)，儿童发病型糖尿病，妊娠糖尿病，或成人发病型糖尿病[2]。Gloyn等人(2004年)研究了29名永久性新生儿糖尿病患者(PNDM2;618856)，对所有29名患者的KCNJ11基因进行了测序，在10名患者中发现了6个新的杂合错义突变[3]。Hani等人(1998年)在法国家庭中发现了KCNJ11基因(600937.0014)的E23K变异与2型糖尿病之间的关联[4]。

本案例结合患儿初发时血糖偏高，糖化血红蛋白偏高，有抽搐发作情况，经小剂量胰岛素积极治疗后血糖维持平稳状态，目前患儿生长发育正常，体重8.5kg，身高67cm。胰岛素治疗后血糖无明显偏高，此患儿血糖变化符合KCNJ11基因变异引起的新生儿糖尿病。

4结论

综上所述，确诊了1例KCNJ11变异导致的新生儿糖尿病患儿，该错义变异既往青海省均未见报道，通过全外显子组测序及临床症状可以从分子层面为新生儿糖尿病的诊断提供依据。

参考文献：

[1]王鸿涵,冯永,王行炜,等.一个迟发性非综合征型常染色体显性遗传性聋家系表型特征及致病基因初步探讨[J].听力学及言语疾病杂志,2012,20(04):309-313.

[2] YORIFUJI T,NAGASHIMA K,KUROKAWA K,et al.The C42R mutation in the Kir6.2(KCNJ11)gene as a cause of transient neonatal diabetes,childhood diabetes,or later-onset,apparently type 2 diabetes mellitus[J].J Clin Endocrinol Metab,2005,90(6):3174-3178.

[3] GLOYN A L,PEARSON E R,ANTCLIFF J F,et al.Activating mutations in the gene encoding the ATP-sensitive potassium-channel subunit Kir6.2 and permanent neonatal diabetes[J].N Engl J Med,2004,350(18):1838-1849.

[4] HANI E H,BOUTIN P,DURAND E,et al.Missense mutations in the pancreatic islet beta cell inwardly rectifying K+channel gene(KIR6.2/BIR):a meta-analysis suggests a role in the polygenic basis of Type II diabetes mellitus in Caucasians[J].Diabetologia,1998,41(12):1511-1515.

基金项目：青海省医学卫生科技项目（2020-wjzdx-99）

通信作者：蒋秀莲