结直肠癌患者中驱动基因突变及微卫星状态与阻塞性睡眠呼吸暂停患病率的关系

摘要：目的：评估结直肠癌(RC)患者中驱动基因突变以及微卫星不稳定性（MSI）与阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）患病率的相关性。方法：本研究共纳入192例自 2020 年 1 月 1 日至 2020 年 12 月 31 日于惠州市中心人民医院病理确诊为CRC的患者，收集临床病理特征，使用下一代测序技术（NGS）进行基因检测，使用可穿戴血氧仪记录睡眠相关指标。以血氧饱和度指数（ODI）≥5作为OSA的诊断标准，分析CRC患者中驱动基因突变以及MSI状态与OSA患病率、睡眠指标的相关性。结果：192名CRC患者中OSA患病率为17.71%。与NRAS野生型患者相比，NRAS突变患者的最低血氧饱和度（LSaO2）、匹兹堡睡眠质量指数（PSQI）评分较低（P<0.05），BRAF突变与较高的LSaO2水平相关（P=0.011），而KARS突变状态与睡眠相关指标无关（P>0.05）。OSA的患病率与KRAS、NRAS和BRAF突变状态无关。MSI状态与睡眠相关指标无关（P>0.05），但与OSA患病率相关（P=0.036），低度微卫星不稳定性（MSI-L）以及微卫星稳定（MSS）患者OSA患病率更高。结论：CRC患者中，驱动基因突变状态与OSA患病率无关，而MSI状态与OSA患病相关，MSI-L或MSS患者OSA患病率更高。

关键词：驱动基因突变；微卫星不稳定性；阻塞性睡眠呼吸暂停；结直肠癌

前言

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球男性第三大、女性第二大癌症，手术仍是早期CRC患者的主要治疗方法，但约25%的患者在诊断CRC时已为晚期或发生远处转移，5年总生存率不足20%[1]。约60%的转移性CRC患者存在KRAS或NRAS基因突变，5%-10%的患者存在BRAF突变，15-20%的患者存在PIK3CA突变[2]，其中KRAS和BRAF突变是预后不良指标。微卫星不稳定性（Microsatellite instability, MSI）是一种由DNA错配修复活性丧失引起的超易变表型，包括高度微卫星不稳定性(high microsatellite instability, MSI-H）、低度微卫星不稳定性（low microsatellite instability, MSI-L）和微卫星稳定（microsatellite stable, MSS），与MSS或MSI-L型CRC患者相比，MSI-H型患者预后更好[3-4]。阻塞性睡眠呼吸暂停（Obstructive sleep apnea, OSA）是一种常见的睡眠呼吸障碍疾病，其主要特征是睡眠时上气道反复塌陷导致的呼吸暂停和/或通气不足，OSA 在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用，与转移性CRC患者较短的无进展生存期和总生存期相关[5]。然而，MSI 状态和驱动基因突变状态是否与CRC患者中OSA患病相关，目前尚不清楚，因此，在本研究将探讨MSI和驱动基因突变状态与OSA的相关性。

研究对象与方法

1. 患者数据收集

本研究纳入2020 年 1 月 1 日至 2020 年 12 月 31 日期间在惠州市中心人民医院确诊为CRC并接受基因检测的患者。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）病理确诊为CRC；（3）完成CRC相关基因检测。(4）完整的临床和随访数据。同时患有其他恶性肿瘤的患被排除在外。匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburgh sleep quality index, PSQI）通过问卷调查获得。本研究经惠州市中心人民医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

2. CRC 患者中OSA患病筛查

采用穿戴式血氧仪（云卫康，中国成都）监测晚上 11:00 到早上 6:00 期间的睡眠状态。睡眠监测信息包括：总睡眠时间（total sleep time, TST）、血氧饱和度指数（oxygen desaturation index, ODI）、平均血氧饱和度（mean oxygen saturation, MSaO2）、最低血氧饱和度（lowest oxygen saturation, LSaO2）和血氧饱和度低于90%的夜间百分比（percent nighttime with oxygen saturation < 90% , Tsat90）。ODI表示短时间反复缺氧到正常状态的转变过程中产生的活性氧的数量[7]，根据ODI将OSA 的诊断标准设定为 ：0~5（正常）和≥5（异常）。

3. CRC患者驱动基因突变检测

使用QIAamp DNA FFP试剂盒提取石蜡包埋的肿瘤组织DNA，并使用Qubit dsDNA HS试剂盒检测DNA浓度。运用“Panel INCa”TruSeq Custom Amplicon 文库制作工具v1.5版）制备文库，使用Illumina仪器测序，采用Sophia DDM软件v.4.3版进行数据分析。

4. CRC患者MSI状态检测

微卫星标记包括6个单核苷酸重复标志物（NR21，NR24，NR27，BAT25，BAT26和MONO27）。存在2个或2个以上不稳定标志物为MSI-H，存在1个不稳标志物为MSI-L，无不稳定标志物则为MSS。

5. 统计分析

使用 SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析。计数资料以百分比（%）表示，组间比较采用卡方检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

研究结果

1. 患者临床特征

本研究共纳入192名患者，其中男性107人（55.73%），女性85人（44.27%），平均年龄为57.42±11.40岁。122名（63.54%）患者（63.54%）为结肠癌，70名（36.46%）为直肠癌，大部分患者分期为III期，占42.71%（82/192）。OSA发病率为17.71%（34/192）。

2. 驱动基因突变情况

192名患者中，90例（48.6%）存在KRAS突变，11例（5.73%）存在BRAFV600E突变，7例（3.65%）存在NRAS突变。在90名KRAS突变患者中，第12密码子突变率为55.56%，第13密码子突变率为27.78%。在密码子12中G12D突变率最高（15.10%），密码子13中只检测到G13D（13.02%），见表1。

表1. CRC患者中KRAS突变位点和突变率

3. CRC患者驱动基因突变状态与睡眠指标之间的相关性

KRAS突变和野生型患者的TST、MSaO2、LSaO2、Tsat90%和PSQI评分差异均无统计学意义（均P>0.05）。与NRAS野生型患者相比，NRAS突变患者的TST更长，LSaO2、PSQI更低（P<0.05），但两组MSaO2和Tsat90%差异无统计学意义（均P＞0.05）。BRAF突变患者的LSaO2明显高于BRAF野生型患者（P=0.011），但两组TST、MSaO2、Tsat90%和PSQI评分差异无统计学意义（均P>0.05），见表2。

表2 CRC患者驱动基因突变状态与睡眠相关指标的相关性

4. CRC患者MSI状态与睡眠指标的相关性

MSI-H组、MSI-L组和MSS组的TST、MSaO2、LSaO2、Tsat90%和PSQI评分差异均无统计学意义（均P>0.05），见表3。

表3. CRC患者MSI状态与睡眠指标的相关性

5. CRC患者中驱动基因突变以及 MSI 状态与其OSA 患病率的相关性

MSI-H组、MSI-L组和MSS组的ODI ≥5患者比例差异有统计学意义（P=0.036），其中MSI-H型患者OSA发生率更低。KRAS突变组和野生组之间ODI ≥5患者的比例差异无统计学意义（P=0.709）。不同NRAS突变状态或BRAF突变状态患者之间ODI ≥5患者的比例差异无统计学意义（均P>0.05），见表4。

表4.  结直肠癌患者中驱动基因突变及MSI状态与OSA患病率的相关性

讨论

多项研究发现，OSA与较高的癌症发病率和癌症相关死亡率有关[7-8]。在西班牙的一项多中心临床队列研究中，发现OSA患者的恶性肿瘤发病率为5.3%（261/4910），其中结直肠癌和前列腺癌占大多数（分别为16.5%和16.1%）[9]。本次研究中，CRC患者中OSA患病率为17.71%，再次证实了OSA与CRC存在相关性。一项前瞻性研究发现，伴有OSA转移性CRC患者的无进展生存期和总生存期明显较短，表明OSA是预测转移性CRC患者预后不良的潜在临床标志物[5]。因此，进一步探讨OSA与CRC之间的关系尤为重要。

驱动基因突变会引发CRC的致癌转化[10]，但驱动基因突变是否与OSA患病相关仍然未知。KRAS和NRAS是RAS基因家族的成员，其中KRAS是CRC中最常发生突变的致癌基因之一，KRAS突变者预后较差，但NRAS突变对CRC患者预后的影响仍存在争议[11-12]。一项荟萃分析显示，NRAS突变可能是CRC患者不良预后的指标[13]。BRAF基因突变并不常见，多项研究证实BRAF基因突变与CRC预后不良显著相关[14]。本次研究中，KRAS突变是CRC患者中最常见的突变，其突变率为46.86%，其中最常见的突变位点是密码子12（66.67%），其次是密码子13（27.78%）；NARS和BRAF突变在本研究纳入的患者中并不常见，突变率分别为3.65%和5.73%，这一结果与目前报道一致。

本次研究首次探讨CRC患者中驱动基因突变与OSA患病率、睡眠相关指标之间的关系，结果显示，NRAS突变患者的LSaO2水平较低，PSQI评分较差，而BRAF突变患者的LSaO2水平较高，KARS基因突变与睡眠相关指标之间没有相关性；此外，以ODI≥5作为OSA的诊断标准时，CRC患者中OSA患病率与KRAS、NRAS和BRAF突变状态无相关性。MSI是DNA错配修复系统缺陷导致的一种独特的分子改变，MSI-H的存在预示着CRC患者具有良好的预后，在II期CRC的治疗决策中起着关键作用[4]。此外，MSI状态还能有效预测免疫检查点抑制剂对晚期CRC患者的疗效[15]。本次研究中，暂未发现MSI状态与睡眠相关指标有关，但它与CRC患者的OSA患病率有关。当以ODI≥5作为OSA的诊断标准时，MSI-H组、MSI-L组和MSS组的OSA患病率分别为0%、21.4%和19.5%，表明MSI-L或MSS患者更易患OSA，因此，我们需要在临床上进行睡眠监测，以便尽早发现和治疗OSA，从而改善CRC患者预后。

此外，我们的研究存在一些局限性，单中心回顾性队列研究中患者选择和数据收集方面可能存在偏倚，后期需要开展大型多中心的前瞻性研究，探讨CRC患者中驱动基因突变以及MSI状态与OSA患病率的相关性。

结论

CRC患者中，驱动基因突变状态与OSA患病率无关，而MSI状态与OSA患病相关，MSI-L或MSS患者OSA患病率更高。

参考文献

[1] Siegel RL, Miller KD, Goding Sauer A, Fedewa SA, Butterly LF, Anderson JC, et al. Colorectal cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin. 2020;70(3):145-64.

[2] Afrasanie VA, Marinca MV, Alexa-Stratulat T, Gafton B, Paduraru M, Adavidoaiei AM, et al. KRAS, NRAS, BRAF, HER2 and microsatellite instability in metastatic colorectal cancer - practical implications for the clinician. Radiol Oncol. 2019;53(3):265-74.

[3] Cancer Genome Atlas N. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 2012;487(7407):330-7.

[4] Kang S, Na Y, Joung SY, Lee SI, Oh SC, Min BW. The significance of microsatellite instability in colorectal cancer after controlling for clinicopathological factors. Medicine. 2018;97(9):e0019.

[5] Lacedonia D, Landriscina M, Scioscia G, Tondo P, Caccavo I, Bruno G, et al. Obstructive Sleep Apnea Worsens Progression-Free and Overall Survival in Human Metastatic Colorectal Carcinoma. J Oncol. 2021;2021:5528303.

[6] Rashid NH, Zaghi S, Scapuccin M, Camacho M, Certal V, Capasso R. The Value of Oxygen Desaturation Index for Diagnosing Obstructive Sleep Apnea: A Systematic Review. Laryngoscope. 2021;131(2):440-7.

[7] Pataka A, Bonsignore MR, Ryan S, Riha RL, Pepin JL, Schiza S, et al. Cancer prevalence is increased in females with sleep apnoea: data from the ESADA study. Eur Respir J. 2019;53(6).

[8] Lee S, Kim BG, Kim JW, Lee KL, Koo DL, Nam H, et al. Obstructive sleep apnea is associated with an increased risk of colorectal neoplasia. Gastrointest Endosc. 2017;85(3):568-73 e1.

[9] Campos-Rodriguez F, Martinez-Garcia MA, Martinez M, Duran-Cantolla J, Pena Mde L, Masdeu MJ, et al. Association between obstructive sleep apnea and cancer incidence in a large multicenter Spanish cohort. Am J Respir Crit Care Med. 2013;187(1):99-105.

[10] Dienstmann R, Connor K, Byrne AT, Consortium C. Precision Therapy in RAS Mutant Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2020;158(4):806-11.

[11] Lian SY, Tan LX, Liu XZ, Yang LJ, Li NN, Feng Q, et al. KRAS, NRAS, BRAF signatures, and MMR status in colorectal cancer patients in North China. Medicine. 2023;102(9):e33115.

[12] Normanno N, Rachiglio AM, Lambiase M, Martinelli E, Fenizia F, Esposito C, et al. Heterogeneity of KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA mutations in metastatic colorectal cancer and potential effects on therapy in the CAPRI GOIM trial. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology. 2015;26(8):1710-4.

[13] Hu Y, Tao SY, Deng JM, Hou ZK, Liang JQ, Huang QG, et al. Prognostic Value of NRAS Gene for Survival of Colorectal Cancer Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 2018;19(11):3001-8.

[14] Karagkounis G, Torbenson MS, Daniel HD, Azad NS, Diaz LA, Jr., Donehower RC, et al. Incidence and prognostic impact of KRAS and BRAF mutation in patients undergoing liver surgery for colorectal metastases. Cancer. 2013;119(23):4137-44.

[15] Nojadeh JN, Behrouz Sharif S, Sakhinia E. Microsatellite instability in colorectal cancer. EXCLI J. 2018;17:159-68.

基金：惠州市2021年省乡村振兴战略专项资金，项目编号：2021SC010312001，项目名称：惠州市癌症大数据调查——2016年-2020年惠州市中心人民医院恶性肿瘤发病及死因调查