P300在子宫内膜异位症中的表达及临床意义

[摘要] 目的：分析子宫内膜异位症（Endometriosis, EMT）患者的在位以及异位内膜与正常子宫内膜中腺病毒E1A结合蛋白（P300）的表达情况，并探讨其临床意义。方法：收集广州市妇女儿童医疗中心2016年1月-2018年12月的正常(非子宫内膜异位症患者)子宫内膜与子宫内膜异位症患者在位以及异位内膜的病理标本，回顾性分析患者的病例资料，年龄、孕产次等基本情况；免疫组化法检测P300 蛋白表达，随后对组织中的腺体、间质以及血管分别进行快速打分。结果：正常子宫内膜组、在位子宫内膜组、异位子宫内膜组三组的年龄以及孕、产次均无统计学差异（P >0.05）；相对于正常子宫内膜组，内异症患者的在位、异位内膜组中的P300总体表达升高，且异位内膜组相较在位内膜组的总体表达水平升高，差异均有统计学意义（P <0.05）；较于正常内膜组，内异症患者的在位、异位内膜组中腺体以及间质的P300的表达均升高，且异位内膜组的腺体的P300表达水平高于在位内膜组，差异均具有统计学意义（P<0.05），而且异位内膜组中的间质的P300表达水平与在位内膜组相比无明显变化，差异不具有统计学意义（P >0.05）；较于正常内膜组，内异症患者的异位内膜组血管中的P300的表达水平升高，有统计学意义（P <0.05），而在位内膜组血管的P300的表达水平无明显变化，差异不具有统计学意义（P >0.05）。结论：内异症患者的在位以及异位内膜中的P300的高表达，可能与内异症的发生、发展以有关，或可成为该疾病治疗的靶点。

【关键词】子宫内膜异位症、P300、乙酰化、药物靶向

The Expression of P300 in Endometriosis and Its Clinical Significance

Liu Jing1; Lu Qinsheng2; Zhao Bin2; Liu Hongyang1; Huang yanqing2; Du miaomiao2; Zhang Lindong1,*

1: Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Henan, Zhengzhou 450000, China

2: Women's and Children's Medical Center of Guangzhou, Guangdong, Guangzhou 510627, China

Abstract Objective: To analyze the expression of P300, a binding protein of adenovirus E1A, in the eutopic and ectopic endometrium of endometriosis patients, and normal endometrium and to explore its clinical significance. Methods: Pathological specimens of normal (non-endometriosis) endometrium and endometriosis patients' eutopic and ectopic endometrium were collected from the Women's and Children's Medical Center of Guangzhou from January 2016 to December 2018. The patients' case data, including age and number of pregnancies and deliveries, were retrospectively analyzed. Immunohistochemistry was used to detect the expression of P300 protein, followed by rapid scoring of the glands, stroma, and blood vessels. Results: There were no significant differences in age, pregnancy and number of deliveries among the normal endometrium group, eutopic endometrium group, and ectopic endometrium group (P > 0.05). Compared with the normal endometrium group, the overall P300 expression in the eutopic and ectopic endometrium groups of endometriosis patients was higher, and the overall expression level in the ectopic endometrium group was higher than that in the eutopic endometrium group, with statistically significant differences (P < 0.05). Compared with the normal endometrium group, the P300 expression of glands and stroma in the eutopic and ectopic endometrium groups of endometriosis patients was higher, and the P300 expression level of glands in the ectopic endometrium group was higher than that in the eutopic endometrium group, with statistically significant differences (P < 0.05). The P300 expression level of stroma in the ectopic endometrium group was similar to that in the eutopic endometrium group, without significant differences (P > 0.05). Compared with the normal endometrium group, the P300 expression level in the vascular tissue of the ectopic endometrium group of endometriosis patients was higher, with statistically significant differences (P < 0.05), while there was no significant change in the P300 expression level of the vascular tissue in the eutopic endometrium group, with no statistically significant differences (P > 0.05). Conclusion: The high expression of P300 eutopic and ectopic endometrium of endometriosis patients may be related to the occurrence, development, and diagnosis of endometriosis, or may become a target for treatment of the disease.

Keywords: Endometriosis; P300; acetylation; drug targeting

子宫内膜异位症（Endometriosis, EMT）是一种雌激素依赖性的慢性炎性病变，其特征是具有生长功能的子宫内膜组织（包括腺体和间质）出现在子宫腔以外的地方，造成盆腔疼痛、肿块结节及不孕等临床症状[1]，其在育龄妇女中的患病率为10 % ~ 15 %[2]。研究表明，异常的表观遗传调控可能与EMT的发生有关。表观遗传学是指在基因序列未发生改变的情况下，基因表达和功能发生可遗传的变化，其主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。组蛋白修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，其中组蛋白的乙酰化由组蛋白乙酰化转移酶（Histone acetylation transferase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同调节[3]。Colón-Día 等在异位内膜间质细胞中检测到HDAC1/2表达水平升高，组蛋白乙酰化水平显著降低，提示组蛋白乙酰化水平异常可能与EMT的发生相关[4]。组蛋白乙酰转移酶，如类固醇受体共激活因子( SRC ) - 1、P300和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白( CBP )，是子宫内膜异位症细胞中活跃表达的基因[5]。P300通过调控下游靶基因的转录或稳定性参与调节细胞的生物学过程，在细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期调节和 DNA 损伤修复等过程中起着广泛的生物学作用[6]。研究表明, P300与肿瘤的发生密切相关，在神经母细胞瘤、急性髓细胞白血病（AML）、小细胞肺癌（SCLC）中 P300的活性或表达水平往往异常升高，其可能通过乙酰化修饰影响多种基因的转录和表达，进而参与肿瘤的发生和发展。虽然内异症是一种良性疾病，但是却被人们称为“不死的癌症”；首先在行为学上来说，它具有某些肿瘤的特性，如增殖、侵袭、转移的生物学行为等；再者，内异症是一种慢性疾病，病程长且易复发，临床数据显示，大约70%的患者可能面临复发，患者往往需要长期管理[7]。本文通过研究P300在内异症中表达水平的变化，进一步探讨P300在内异症发生、发展之间的作用，为药物治疗提供理论依据。

1.资料与方法

1.1一般资料

收集2016年1月-2018年12月7年广州市妇女儿童医疗中心的正常女性和内异症患者在位和异位的子宫内膜组织病理标本及其病历基本信息；收集正常女性子宫内膜标本（正常组）（n=11）和内异症患者在位子宫内膜标本（在位内膜组）（n=15），内异症患者异位子宫内膜标本（异位内膜组）（n=12）；入组和排除标准如下：正常组：入组标准：（1）年龄：20-45 周岁；（2）正常女性或子宫肌瘤或子宫内膜息肉患者未经药物治疗（3）3个月内无激素和避孕药使用；（4）3个月内无其他疾病的药物治疗史；（5）体重正常； 排除标准：（1）绝经（2）子宫内膜炎、子宫内膜癌或有其他子宫内膜病变；（3）有其他感染或可影响子宫内膜的疾病情况；（4）孕妇和哺乳期女性。内异症组：入组标准：（1）行手术治疗，病理诊断为子宫内膜异位症的患者，包括卵巢巧克力囊肿、腹膜型内异症和深部浸润子宫内膜异位症患者； (2) 3个月内无激素、避孕药或其他药物使用; (3) 年龄 20-45 周岁; (4)BMI正常；排除标准：（1）病灶较小无需手术治疗者；（2）有严重肝肾 功能障碍及自身免疫性疾病病史；（3）妊娠期或哺乳期；（4）有严重不良反应；本研究经广州市妇女儿童医疗中心医学伦理委员会批准，伦理批件：穗妇儿伦理审批第（2017102709）号。

1.2 方法

免疫组化法检测P300蛋白表达。将组织蜡块以5 um厚度连续切片，将切片烘烤90min; 依次用二甲苯、95%、85% 、75% 乙醇、dd H2O脱蜡，在柠檬酸盐缓冲液( pH 9.0 )中加热进行抗原修复。样品冷却至室温后，PBS冲洗，用10%H2O2,滴加在每张组织切片上，室温孵育15 min, PBS液冲洗后滴加山羊血清封闭30 min, 滴加 P300 一抗（碧云天，AF6795），稀释浓度为1:6000, 4℃过夜；PBS冲洗，滴加HRP标记的二抗，室温下孵育90 min, PBS冲洗，DAB显色后清水冲洗，置入苏木素中复染1min，清水中返蓝，乙醇梯度脱水，光学显微镜下进行观片。P300位于细胞质以及细胞核，细胞质以及细胞核出现棕黄色颗粒或棕褐色颗粒为阳性。统计分析P300 在正常子宫内膜以及内异症在位、异位内膜的表达；每张切片的分析采用改良的"快速评分"方法，同时考虑染色的细胞百分比( 1=0 ~ 25% , 2>25 ~ 50% , 3>50 ~ 75% , 4>75 ~ 100%)和每个百分比( 0=阴性, 1=弱, 2=中等, 3=强)的染色强度( 0=阴性, 1=弱, 2=中等, 3=强)，然后将百分比和强度得分相乘并求和，以给出0 ~12的可能得分范围。

1.3统计学处理

采用Graph Pad Prism 9.0和SPSS 25.0软件进行统计分析和作图。多重比较采用单因素方差分析( ANOVA )和Dunnett’s 检验。计量资料中服从正态分布的数据以（ ± s）描述，不服从正态分布 的以 M（P25，P75）表示。三个独立样本定量资料服从正态分布用单因素方差分析，不服从正态分布用 Mann-Whitney U 检验；认为P < 0.05为差异有统计学意义。* :P < 0.05，** : P < 0.01，***: P < 0.001。

2.结果

2.1.基线资料

三组的年龄、孕次、产次比较，差异均无统计学意义（P >0.05）（表1）

表格 1三组年龄、孕次、产次、剖宫产的情况比较

2.2.免疫组化法检测组织中P300蛋白的表达

通过对内膜组织进行P300的免疫组化染色发现,相较于正常组，在位、异位内膜组P300的总体表达均升高，且均具统计学意义（P <0.05）；内膜组织中腺体以及间质的P300的表达：较于正常组，在位、异位内膜组的腺体以及间质中的P300的表达均升高，且异位内膜组的腺体的表达高于在位内膜组中的腺体，均具有统计学意义（P <0.05）； 内膜组织中血管的P300的表达：较于正常内膜组，内异症患者的异位组织血管中的P300的表达升高，且具有统计学意义（P <0.05），而在位内膜组P300的表达均值有所增加，但差异不具有统计学意义( P >0.05) （表2）；

表格 2三组P300表达的情况比较

注：P1：正常组VS在位内膜组；P2：正常组VS异位内膜组；P3：在位内膜组VS异位内膜组

图1：P300在三种内膜组织的免疫组化染色图

图2：P300的免疫组化打分统计分析图

Ctrl: 正常子宫内膜组织；EuEM: Eutopic endometrial tissues: 在位子宫内膜组织；EcEM: Ectopic endometrial tissues：异位子宫内膜组织；

3.讨论

3.1 P300的生物学作用

P300是一种乙酰化酶，也称为组蛋白乙酰转移酶（HAT），其酶活性不仅限于组蛋白，还通过重塑其他染色质相关蛋白和上游信号介导介质来调节转录，如转录因子E2F1、P53、MYC等，从而在细胞增殖和分化中发挥重要作用[8]。P300在细胞生物学中的作用：1. 调控基因表达：P300通过乙酰化修饰组蛋白和其他转录因子，调控基因表达的启动和抑制。这种调控作用在细胞分化、增殖和凋亡等过程中起着关键作用。2.细胞周期调控：P300是细胞增殖所必需的，其参与细胞周期的调控。P300 是一种具有内在组蛋白乙酰转移酶活性的转录共激活因子，其活性以细胞周期依赖性方式进行调节，在 G1/S 转换期间发挥重要功能。3.DNA损伤修复：P300还参与DNA损伤修复过程，通过乙酰化修饰相关蛋白来增强DNA修复酶的活性，从而维护基因组的稳定性。尽管在大多数研究中P300 是一种肿瘤抑制因子，但其致癌作用也已在多种癌症类型中得到证实，它参与表型转换、增殖 和细胞凋亡等。P300 高表达，肝细胞癌、食管鳞状细胞癌、鼻咽癌、乳腺癌、皮肤鳞状细胞癌和小细胞肺癌以及非小细胞肺癌的总生存率较差[9]，但P300过表达与非小细胞肺癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤生存率的提高有关[10]。因此，P300的高表达和低表达都有助于肿瘤侵袭和对化疗的耐药性[11]。一些癌症类型，包括膀胱癌、宫颈癌和口腔癌，其特征是编码组蛋白乙酰转移酶EP300的频繁突变。[8]

3.2 乙酰化与内异症之间的联系

近年来，科学研究揭示出乙酰化在EMT发生过程中起到了关键性的作用。乙酰化酶3（HDAC3）在EMT的子宫内膜上皮细胞和基质细胞中低表达，HDAC3的缺失会与异位内膜组织的纤维化有关[12]。沉默调节蛋白1（SIRT1）是经典Ⅲ类去乙酰化酶，可介导组蛋白及非组蛋白的去乙酰化过程，非EMT子宫内膜对比，EMT在位内膜SIRT1表达明显增加，可能与孕激素的抵抗有关[13]。EMT是一种受激素影响而发病的疾病，其中雌激素和孕激素在该病症的起始与发展阶段扮演着至关重要的角色。P300可以乙酰化雌激素受体α（ERα），乙酰化相应的位点后可提高DNA 结合活性，导致其转录活性随之增加[14]，P300可能通过调节雌激素受体的乙酰化进一步影响疾病的发生；异位组织的HDAC1高表达，会使ERα 启动子区乙酰化水平降低，抑制ERα 转录EMT异位病灶ERα 与ERβ 比例较在位内膜下降，成为优势受体的ERβ 介导异位病灶的侵袭、增殖、炎症反应等过程[15]。

本研究免疫组化的结果提示：内异症患者的在位以及异位内膜中的P300的表达均升高，更进一步说明了P300与内异症的发生、发展的密切关系，提示P300作为转录调节因子，可能参与这些生物过程的调控，但其具体机制尚需进一步研究。P300在EMT在位、异位内膜的腺体及间质的高表达可能与内膜的增殖和侵袭相关，其可通过调节相关基因的表达促进在位内膜腺体的增殖和分化，也可能增强内膜的侵袭能力，使其更容易在子宫腔以外的部位生长和蔓延。P300在EMT的异位内膜的血管中呈现高表达，血管生成是内异症病灶形成和建立的必需过程，也被认为是内异症发展的重要因素，是决定异位病灶最终是否存活的关键步骤[16]，P300的高表达提示其与异位病灶的血管的生成有关。

3.3 P300有望成为治疗内异症的治疗的靶点

由于P300在多种肿瘤中的重要作用，它成为药物筛选的重要靶点。目前已有多种P300抑制剂在临床上取得了效果。CCS1477：是一种高度选择性的P300/CBP溴结构域抑制剂，用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌、转移性乳腺癌和非小细胞肺癌，目前正处于临床试验中。P300 抑制剂增强了吉西他滨诱导的胰腺癌细胞凋亡[17]。Chetomin是一种代谢物复合物，可通过靶向 HIF-1α/EP300 复合物来改善 多发性骨髓瘤患者的不良预后[18]；咪达唑仑通过下调 P300 表达来抑制人头颈部 SCC 细胞的增殖[19]。P300 抑制剂 C646 诱导急性髓性白血病细胞的细胞周期停滞和凋亡[20]；与正常口腔粘膜上皮细胞相比，P300在口腔鳞癌中高表达，干扰癌细胞中的P300的表达，可抑制癌细胞的增殖与迁移[21]，研究表明P300在肝癌组织中高表达，干扰 P300 表达能够明显抑制肝癌细胞侵袭和迁移，其可能通过WNT通路在肝癌的发生发展中发挥促癌作用，有望成为肝癌防治的新靶点[22]。通过开发针对P300的药物或疗法，可能有助于降低内异症的发生风险或改善其症状。未来研究应进一步探讨P300在内异症中的具体作用机制，包括其如何影响激素和免疫调节等生物过程，以及与其他相关基因的相互作用等。随着对P300功能的深入了解，未来可能实现针对内异症的个体化治疗。虽然P300在内异症中呈高表达，但是对于P300与内异症疾病之间的因果关系并未有证据说明，究竟是因为P300的表达水平升高而对转录因子进行调控，使得内膜细胞的黏附、增殖、侵袭、迁移能力发生改变，而进一步引发该疾病；还是因为患者本身患有该疾病而使得组织中的P300的表达水平升高，产生进一步的效应，暂未可知；仍需进行深入的研究对P300 在内异症发生发展过程进行机制探讨，更可以为该疾病的发病机制以及治疗提供充分的证据。

综上所述，P300在内异症的在位、异位内膜的表达升高提示：P300与子宫内膜异位症的发生之间存在密切关系。通过深入研究P300在内异症发生发展过程中的功能和调控机制，可能为内异症的治疗提供新的思路和方法。P300抑制剂在临床上具有潜在的应用价值，特别是在癌症治疗中展现出良好的前景，但其安全性和耐药性等问题仍需进一步研究和解决。随着科学技术的不断进步和临床研究的深入开展，相信会给内异症患者带来福音，这一难题终会迎刃而解。

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