富氢水在缓解血管性痴呆大鼠氧化应激和炎症反应中的作用研究

摘要：本研究通过改良MCAO法构建血管性痴呆（VD）大鼠模型，设置对照组及实验组，采用mNSS评分、HE染色等方法，探讨富氢水对VD大鼠的神经保护作用及机制。结果表明，富氢水可改善VD大鼠神经功能，减轻脑组织损伤；中、高剂量能激活PI3K/AKT通路抑制细胞凋亡，降低氧化应激与炎症反应。该研究证实富氢水可为VD治疗提供潜在策略，但机制仍待深入研究。

关键词：富氢水；血管性痴呆；PI3K/AKT/Caspase-9通路。

引言

当今社会，血管性痴呆（VD）作为一种常见疾病，全球约有6000万人遭受VD之苦，预计到2050年将上升至1.6亿[1]。然而，VD的发病机制尚未明确，其进展涉及到多种机制，如促凋亡信号通路的激活等。[2]磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）/半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶9（Caspase-9）通路是多种神经系统疾病中的关键通路，释放的活性氧物质和炎症因子，可诱导ICAM-1和VCAM-1的表达增加。[3]富氢水具有选择性抗氧化，抑制细胞凋亡等作用，对脑缺血具有一定治疗作用。但富氢水能否改善血管性痴呆未见相关报道，故本研究采用了一系列方法，旨在观察富氢水对血管性痴呆的改善情况并探索PI3K/AKT/Caspase-9通路及下游在其中的作用。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体重 200-250g，共30只，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，许可证号SCXK（黑）2019-001。

1.2 药物试剂与仪器设备

CX31R BSF光学显微镜（Olympus）；DP801图像分析系统（Alphamiager公司）；DK-8D电热恒温水浴箱（上海合恒仪器设备有限公司）；METTLER TOLEDO PH测试仪（上海秋腾贸易有限公司）；79-1磁力加热搅拌器（上海雷磁新泾仪器有限公司）。富氢水（北京活力氢源健康科技有限公司）；GHPDH抗体(Beyotime AF0006)；兔抗PI3K抗体(Beyotime AF5905）；兔抗AKT抗体(Beyotime AA326）；兔抗Caspase-9 AF1264。

1.3 造模和分组

所有大鼠适应性喂养1周后，随机分成对照组、模型组（VD）、低（VD+LHRW）、中（VD+MHRW）、高剂量干预组（VD+HHRW）,每组6只，共30只。采用改良的MACO方法造模,每天灌胃1次，于造模第14天处死大鼠开展实验。对照组、VD组给予纯化水20 mL·kg−1；低、中、高剂量组分别给予富氢水10、15、20mL·kg−1。

1.4 检测方法

1.4.1 行为学检测

术后1、7、14天，采用mNSS行为学评分表评估大鼠的神经系统损伤及恢复情况。评价内容包括运动、感觉、平衡、反射实验，分值范围为1-18分，评分越高提示神经功能缺损程度越严重。

1.4.2 HE 染色检测脑患侧组织病理变化

在照射后第7天，使用2.5%戊巴比妥钠将大鼠麻醉后解剖。取大鼠脑组织用4%多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片（4μm），苏木精和伊红染色，二甲苯透明、中性树脂封片。用光学显微镜观察。

1.4.3 Western blot法检测蛋白相对表达量

取各组大鼠脑组织充分研磨，4℃预冷，加入RIPA裂解液，用匀浆器裂解离心10min取上清液，用BCA法检测蛋白质浓度。向组织上清中加5倍上样缓冲液，在100℃水浴加热后置于－20℃冰箱。经制胶、电泳、转膜、封闭后，孵育ICAM-1、tPA、ET-1，并以GAPDH为内参，4℃过夜。次日孵育特定种属二抗，在WB成像仪曝光采图，灰度值分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行分析，组内比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 行为学指标变化

一天后，与对照组相比，其他组别的大鼠评分都显著升高（P<0.01）；7天后，与VD组相比，VD+LHRW组、VD+MHRW组、VD+HHRW组显著降低（P<0.01）；14天后，与VD组相比，VD+LHRW组、VD+MHRW组、VD+HHRW组大鼠各项神经严重评分均显著降低（P<0.01）；具体见以下表格。

与对照组比较，a:P<0.01;b:P<0.01;c:P<0.01

2.2 患侧脑皮质病理学改变

对照组脑组织结构正常；VD组脑组织损伤显著，神经元排列紊乱，细胞核大量固缩、破碎、溶解；VD＋HHWR组脑组织较VD组明显好转，神经元排列趋于正常，仅有少量细胞核固缩。见图1。

2.3 PI3K/AKT/Caspase-9 通路相关蛋白质的表达水平

与对照组相比，VD组大鼠的p-PI3K，p-AKT的表达量显著降低，蛋白Caspase-9的表达量显著降低（图2 B-D）（P＜0.05）；与VD组相比，VD+MHRW组和VD+HHRW组p-PI3K显著增加,p-AKT增加效果不明显（p＞0.05）,蛋白Caspase-9的表达量显著降低（图2 B-D）（p＜0.05）。

图2

3讨论

本研究通过对 PI3K/AKT/Caspase-9 信号通路关键分子的检测分析显示：VD大鼠海马组织中 PI3K蛋白及pAKT的表达量下调，进而促使促凋亡因子Caspase-9的蛋白表达水平显著升高。而富氢水干预实验结果表明，该干预手段可通过上调 PI3K、AKT的蛋白表达量，重新激活 PI3K/AKT 信号传导通路。通路激活后，促凋亡因子Caspase-9的蛋白表达水平得以显著下调，从而减轻神经元凋亡损伤，对认知功能起到改善作用[4]。

参考文献:

[1]MA T M,GRIMM J,MCINTYRE R,et al.A prospective evaluationof hippocampal radiation dose volume effects and memory deficits following cranial irradiation[J].Radiother Oncol, 2017, 125（2）: 234-240.

[2]Wang Y, Liu Y, Zhang H, et al. Oxidative stress regulates the expression of PAI-1 through the PI3K/Akt signaling pathway [J].Free Radical Biology and Medicine,2019,141:408-416.

[3]OHSAWA I，ISHIKAWA M，TAKAHASHI K，et al．Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals［J］．Nat Med，2007，13（6） : 688-694．

[4]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat［J］.Stroke,1989,20（1）：84-91

项目名称：齐齐哈尔医学院大学生创新创业训练计划项目富氢水对血管性痴呆大鼠氧化应激及炎症反应的缓解作用

项目编号：S202311230058

作者简介：杨恒毅（2003.2-）男 ，汉族，本科学历，籍贯：河南安阳，研究方向：缺血性脑卒中