凝血因子XII46C/T基因多态性与脑出血风险的相关性研究

[摘 要] 目的：使用高分辨率溶解曲线（HRM）分析 凝血因子XII（FXII）基因外显子1的46C/T多态性，并讨论其多态性与脑出血风险性的相关性。方法：收集广东省第一荣军优抚医院住院病人脑出血组（60例）与正常体检人群对照组（80例）的外周血，提取DNA,用凝血因子XII（FXII）基因特异性引物进行荧光定量PCR，并且对PCR产物进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析，从而对FXII基因外显子1的 46C/T基因分型。结果：HRM方法能快速分辨出CC、CT、TT三种不同等位基因类型，FⅫ 46TT基因型在脑出血里出现频率高，分别与FⅫ46CT、46CC基因型比较，差异都有显著性意义（P＜0.01），FⅫ46CT与46CC基因型在脑出血里出现频率比较（P>0.05）差异无显著性意义。结论：FXII基因46TT多态性与脑出血的发生有关联，是脑出血发生的风险因素之一。HRM方法能快速对基因位点进行筛查，可以在临床上推广应用。

[关键词] 脑出血；凝血因子XII；高分辨溶解曲线

凝血因子Ⅻ(FⅫ)又叫接触因子,是一种糖蛋白,分子量为9万,球蛋白电泳位于β或γ位置,是参与凝血过程的一种因子，为内源性凝血系统的启动因子,与胶原组织或异物等接触即被激活,人产生于肝脏，这个单链酶原被激活后形成一个双链的丝氨酸蛋白酶，即一条重链（FⅫa）和一条轻链。在体外，易与带负电荷的表面如硅酸盐、硫酸葡聚糖、硫脂类等结合；在体内，FⅫ与胶原或血小板膜接触而被激活[11.13]FⅫ对前激肽释放酶和FⅪ等蛋白质底物具有酶活性，这2种蛋白质在血浆中与高分子量激肽原结合成无活性的酶原复合物。在活化的凝血系统表面，高分子量激肽原 前激肽释放酶复合物、高分子量激肽原 FⅪ复合物及FⅫ结合于损伤部位的负电荷表面。结合于表面的FⅫ通过限制性蛋白酶激活前激肽释放酶，而产生的激肽释放酶裂解FⅫ产生FⅫa。FⅫa的产生使前激肽释放酶与FⅫ进一步相互激活。FⅫa接着激活与表面结合的FXI，进而引发后继的凝血级联反应。Kanaji等在FXII外显子1的基因启动子区第46位核苷酸发现一个常见的多态性 C→T（FXII46C→T），导致FXII蛋白翻译减少，可能影响凝血功能,脑出血是一种常见的中老年疾病，脑出血（cerebral hemorrhage）是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，早期死亡率很高，幸存者中多数留有不同程度的运动障碍、认知障碍、言语吞咽障碍等后遗症。目前依然病因不明，为研究脑出血病人中是否可能存在凝血系统长期异常，本文收集人脑出血组（60例）与正常体检人群对照组（80例）看其发病风险是否与凝血因子XII46C/T基因多态性相关。

1.1研究对象和方法

1.1研究对象

     收集2023年5月至2024年12月广东省第一荣军优抚医院住院部脑出血患者60例（脑出血组），男35例、女25例，平均年龄69岁，患者在采集标本前未使用任何促凝药物，肝功能均正常。正常对照组80例，男女各40例，平均年龄66.85岁，肝功能正常，无心脑血管疾病，未使用任何药物。

1.2方法

1.2.1标本采集

采集两组受试者静脉血2ml于含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管中。

1.2.2血液DNA提取：

200ul全血，用qiagen公司血液基因组DNA小提试剂盒QIAamp Blood Mini Kit提取，最后得到50ul提取的基因组DNA。

1.2.3定量PCR反应

采用Roche罗氏LightCycler® 480实时荧光定量PCR仪配备HRM模块荧光定量试剂盒采用TAKARA公司TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)，引物由生工公司合成

上游引物XIIF序列:GATAGGCAGCTGGACCAACG

下游引物XIIR序列:TGATAGCGACCCCCCAGAAC

反应体系为TB Green Premix Ex Taq10 μl；上下游引物10 μM各0.4μl；提取的血液DNA2 μl,去离子水 7.2 μl定量PCR程序：95℃ 30s 1cycle;95℃5s 60℃30s循环40cycle。

1.2.4，高分辨率溶解曲线。

将上述定量PCR产物进行高分辨溶解曲线程序分析，以下为分析程序：95℃ 5s( Ramp rate：4.4℃/s);60℃1min( Ramp rate：2.2℃/s); 95℃(Ramp rate：0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃) 1 cycle

1.3 数据统计

凝血因子XII基因表型外显子1的45TT、46CC、46CT表型与脑出血发病的相关性分别进行组间卡方检验，P<0.05有统计学意义。

2 结果

图1  46C/T位点PCR产物溶解曲线图

 图2  46C/T位点PCR产物溶解曲线负导数图

 图1图2中A;B;C分别代表的TT型、CT型和CC型PCR产物溶解曲线和PCR产物溶解曲线的负倒数图，由图可见TT型、CT型和CC型Tm值分别为85.44°C、86.22°C、86.88°C。

FⅫ 46TT基因型在脑出血里出现频率高，与FⅫ46CT、46CC基因型比较，差异都有显著性意义（P＜0.01），FⅫ46CT与46CC基因型在脑出血里出现频率比较（P>0.05）差异无显著性意义。

3 讨论

FXII基因位于5号染色体(5q33 qter)，1998年，]Kanaji T等发现在FXII基因5’端非翻译区、atg起始密码子的上游4个碱基处的46 c/t基因型为多态性位点,FXII基因外显子的46位存在C→T置换，因而在人群中可存在3种基因型：46CC、46CT、46TT。46位点的不同基因型就导致ATG起始密码子改变，从而影响FXII的表达量导致FXII蛋白翻译减少。后续其他不少研究也有证明CC、CT的基因型相对TT表型有更高的FXIIa 蛋白浓度,可能影响凝血功能。 目前研究认为FXII蛋白缺乏症目前并不会出现出血倾向，但有可能长期的FXII蛋白的长期缺乏对机体产生影响，引起中老年以后发病。脑出血是一种常见疾病，多见于中老年患者，可分为原发性脑出血和继发性脑出血（15%～20%），原发性脑出血比继发性脑出血更为常见，是起源于小血管自发破裂的脑内出血，其病因在病理生理方面可能有长期高血压和淀粉样血管病的影响，但在基因方面病因不明，脑出血患者平时并无出血倾向，但也可能存在凝血功能异常，而脑出血多在中老年发病，可能与凝血系统长期异常有关，FXII基因外显子46C→T能引起 FXII蛋白翻译显著减少，因此作者选择对观察对FXII46C/T基因多态性与脑出血风险进行相关性研究。

本文研究结果显示，FⅫ 46TT基因型在脑出血里出现频率高，与FⅫ46CT、46CC基因型比较，差异都有显著性，因此FⅫ 46TT可以看作是导致脑出血的高危因素，FⅫ蛋白的缺乏可导致脑出血高风险,近年来有研究使用针对FⅫa抑制剂预防血栓类疾病，认为并不会造成出血风险],作者认为需考虑FⅫ缺乏造成长期风险，应进行长期评估。

HRM技术是PCR扩增技术与溶解曲线分析技术相结合，依靠高分辨温度检测PCR仪和新型饱和荧光染料实现基因序列分析的技术。其原理是在PCR完成之后，直接对PCR扩增产物运行高分辨溶解程序，通过仪器检测扩增子中饱和荧光染料的荧光强度变化，获得特征性溶解曲线，最后根据溶解曲线的位置和形态变化来判断序列的变异情况，能够区分单个碱基的序列差异。溶解曲线的形状及位置主要与扩增产物的长度及GC含量有关，不同核酸分子的GC含量及GC分布存在差异，因此双链DNA分子在加热变性时其Tm值也不同，会形成特殊的溶解曲线形状和位置。HRM 的优势在于操作简单，分析时间短，灵敏度和特异性高，非常适合在临床上推广使用， 临床检验中也可对FXII基因外显子1的46C/T位点进行筛查，为疾病的预防和治疗提供参考。

4 参考文献

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[8]. Schmaier AH. The elusive physiologic role of Factor XII. J Clin Invest 2008;118:3006–3009.[PubMed: 18725991]

第一作者：汪芳  性别：女  单位：广东省第一荣军优抚医院  邮编：510260  民族：汉  籍贯:江西  出生年月:1980年3月  学历：本科  科室：检验科  现有职称：主管检验师