A型肉毒毒素对大鼠肌腱腱周瘢痕粘连抑制作用的研究

[摘要]目的：探讨A型肉毒毒素对大鼠肌腱腱周瘢痕粘连的抑制作用。方法：大鼠肌腱损伤建模，大鼠后肢跟腱横行切断后缝合，分组用含有不同药物的明胶海绵（面积1cm×1cm）外敷肌腱腱周缝合部位，各组药物的剂量为：低浓度药物组含50mg A型肉毒毒素，高浓度药物组含100mg A型肉毒毒素，阳性对照组含0.5mL医用几丁糖。4周后评估跟腱粘连分级，取跟腱组织进行HE染色评估肌腱愈合、肌腱粘连和腱周炎症情况。分离大鼠肌腱组织,培养肌腱成纤维细胞，采用ELISA法测定IL-6和TGF-β的表达含量。结论：A型肉毒毒素可以有效加速肌腱愈合，抑制腱周瘢痕粘连，改善腱周炎性浸润。同时，能够明显降低体外培养的肌腱成纤维细胞中IL-6和TGF-β的表达，在相对适合的浓度下，作用强度达到高峰，从而在一定程度上抑制大鼠肌腱腱周瘢痕粘连，改善肌腱损伤术后的功能恢复。

[关键词] A型肉毒毒素；肌腱；瘢痕；粘连

创伤后肌腱损伤及手术修复后发生的瘢痕粘连，会严重影响关节功能的恢复，成为临床亟待解决的难题[1]。如何降低创伤后腱周瘢痕增生的发生率，尽快恢复肌腱滑动功能，同时又不影响肌腱本身的愈合，成为近年研究的焦点[2]。临床中，A型肉毒毒素广泛应用于治疗皮肤增生性瘢痕，可以使瘢痕变软变平，瘢痕增生明显改善[3]。特别是治疗烧伤后的瘢痕愈合有十分显著的疗效。体外细胞培养实验证明，A型肉毒毒素不仅使增生性瘢痕成纤维细胞增殖减慢，而且使成纤维细胞胶原蛋白的合成能力减弱[4]，进一步为我们用A型肉毒毒素抑制创伤后腱周组织瘢痕增生的研究提供了理论基础。

实验组为进一步揭示A型肉毒毒素抗肌腱纤维化、抑制腱周组织瘢痕粘连的作用，扩大A型肉毒毒素的治疗范围，提供其预防肌腱腱周组织瘢痕增生的实验基础。建立大鼠创伤后肌腱生长的动物实验模型，不同浓度A型肉毒毒素外敷， 4周后评估跟腱粘连分级，取肌腱组织进行HE染色评估肌腱愈合、肌腱粘连和腱周炎症情况。取肌腱组织,培养肌腱成纤维细胞，采用ELISA法测定IL-6和TGF-β的表达含量。实验拟探索A型肉毒毒素是否能有效调节抑制创伤后局部腱周组织粘连的症状，为临床药物防治腱周组织瘢痕化提供新思路。

1 材料与方法

1.1.材料

SPF级6周龄雄性Wistar大鼠购买于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。饲养条件：温度20-26℃，湿度40%-70%，正常饲料喂养，自由饮水。适应性饲养7天后开始构建大鼠肌腱损伤模型。注射用A型肉毒毒素 (兰州生物制品研究所有限责任公司，衡力BTX-A，100U/支,国药准字310970037)，苏木素染液，伊红染色液，苏木素返蓝液，IL-6和TGF-β的ELISA 检测试剂盒，胎牛血清、DMEM培养液等，恒温水浴槽，台式离心机，全自动酶标仪等，组织脱水机，石蜡包埋机，切片机，摊片机，电热恒温鼓风干燥箱，显微镜（CX43，OLYMPUS）等。

1.2方法

麻醉大鼠，俯卧位固定，右下肢备皮消毒后，在跟腱后方纵行切开皮肤，暴露跟腱，在止点5mm处横行切断跟腱，采用Kessler缝合法，使用5-0肌腱缝线将跟腱断端缝合。构建大鼠肌腱急性损伤模型后，随机分组用包含不同药物的明胶海绵（面积1cm×1cm）包裹损伤肌腱断端周围，各组干预药物的剂量为：模型组含0.5mL生理盐水，低浓度药物干预组含50mg A型肉毒毒素，高浓度药物干预组含100mg A型肉毒毒素，阳性对照组含0.5mL医用几丁糖。分别于术后4周处死各组大鼠，暴露大鼠跟腱，评估肌腱愈合分级，并系统评估（见表1）。取肌腱组织进行石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，HE染液、切片脱水、封片，在显微镜下观察并进行评估肌腱愈合、粘连、炎症分级评估（见表1、2、3）。切取跟腱腱性组织，置于0.25%胰酶，4℃冷消化24小时，充分打碎后，加入0.25%I型胶原酶，37℃孵育1小时，收集细胞悬液，1000rpm离心5分钟，加入含有15%胎牛血清的DMEM培养液，每48h换置培养液一次，细胞融合至80%接种。实验选用第3、4代细胞。采用大鼠IL-6和TGF-β的ELISA试剂盒检测不同实验组中，肌腱成纤维细胞的表达水平。

1.3统计学分析

应用Graphpad Prism 8.0软件进行图形绘制和统计分析。定量结果采用均数±标准差（X±S）表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组之间定量数值比较采用单因素方差分析，事后检验采用Tukey法，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 A型肉毒毒素作用下大鼠肌腱愈合和粘连情况

大鼠造模后给予不同药物进行干预4周，检测干预前后大鼠肌腱愈合和粘连情况，与组相比，空白对照组相比，模型对照组的粘连分级评分显著升高，表明模型构建成功，与模型对照组相比，给予不同浓度A型肉毒毒素药物处理后，评分没有显著变化。（见图1）

图1 ：跟腱粘连分级评分；*代表与空白对照组相比，P<0.05。

2.2 HE染色评估肌腱愈合、肌腱粘连和腱周炎症情况

HE染色结果图2所示，HE染色结果可见空白对照组组肌纤维排列整齐，无明显病理变化；模型对照组肌纤维排列紊乱，并伴有炎性细胞浸润；A型肉毒毒素低浓度组肌纤维排列松散紊乱，仍有炎性细胞浸润；A型肉毒毒素高浓度组肌纤维排列相对整齐有序，未见炎性细胞浸润；阳性对照组组肌纤维排列平整有序，未见炎性细胞浸润。（见图2，见表5）

空白对照组    模型对照组   低浓度BTX-A组  高浓度BTX-A组   阳性对照组

图2： HE染色

2.3  A型肉毒毒素对肌腱成纤维细胞中FGF2和MMP-2表达的影响

在A型肉毒毒素作用下，腱鞘成纤维细胞中IL-6和TGF-β的表达呈现不同程度的抑制作用。高浓度药物干预组抑制作用最强，差异有统计学意义，P<0.05。（见表4）

表1：肌腱愈合分级标准表

 表2：肌腱粘连分级标准表

表3：肌腱炎症分级标准表

表4 A型肉毒毒素对肌腱成纤维细胞IL-6、TGF-β的表达影响（pg/mL）

表5 肌腱愈合、肌腱粘连和腱周炎症分级表

表注：*代表与空白对照组相比，P<0.05；#代表与模型对照组相比，P<0.05

3. 分析与讨论

3.1 肌腱腱周瘢痕粘连的治疗方案

尽管不断改进肌腱修复技术，术后腱周组织瘢痕增长导致的粘连仍作为最常见的并发症严重影响创伤后肌腱的功能恢复[5]。临床尝试应用于抑制肌腱腱周瘢痕增生的方法多样，结合药物治疗、物理治疗、手术和生物治疗等多种手段。

3.1.1药物治疗

①口服非甾体抗炎药：有效减少肌腱腱周组织的炎症反应，减少炎性介质的释放，改善局部充血、水肿情况，抑制纤维化肌腱粘连的形成[6]；②注射糖皮质激素：腱周局部注射曲安奈德等糖皮质激素，可减少炎症，软化瘢痕、抑制增长、减轻瘙痒等症状[7]；③抗纤维化药物的使用：秋水仙碱、尿氟嘧啶等药物的使用，也在一定程度上抑制肌腱纤维化的进程[8]。

3.1.2物理治疗

①压力疗法：使用弹性绷带、压力袜或定制压力装置对增生部位加压，减少瘢痕血供，抑制增生；②激光治疗：脉冲染料激光、二氧化碳点阵激光等，能刺激胶原蛋白生成，改善腱周瘢痕组织的形成[9]；③其他疗法：超声波治疗、红外线照射、冷冻治疗、离子导入等，可促进局部血液循环，改善肌腱周瘢痕组织代谢[10]。

3.1.3康复训练

康复训练可增加踝关节活动度、增强腱性组织的力量、改善血液循环，减缓腱周瘢痕增生，但难以单纯依靠康复训练完全恢复，需要在专业康复治疗师指导下进行复健。

3.2 A型肉毒毒素对肌腱腱周瘢痕粘连的抑制作用

A型肉毒毒素对瘢痕增生肌腱粘连具有明显的改善作用，广泛应用于皮肤组织。随着研究的深入，逐渐应用于改善肌腱修复术后腱周瘢痕组织的增生。A型肉毒毒素可抑制乙酰胆碱释放，使肌肉松弛，减少对肌腱的牵拉，从而降低腱周瘢痕增生的刺激因素[11]。同时，可以使局部血管扩张，改善肌腱腱周血液循环，为组织修复创造良好环境，减少因缺血缺氧导致的炎症反应和瘢痕增生。本实验组通过跟腱离断并缝合修复构建大鼠肌腱损伤模型，通过实验在肉眼下及镜下观察药物干预下，对腱周瘢痕组织增生的抑制作用。

3.2.1肉眼观测及评分

大鼠肌腱缝合造模后，给予不同药物浓度的A型肉毒毒素进行干预4周，暴露大鼠肌腱组织，肉眼下观察腱周组织的愈合和粘连情况，结果提示，在明胶海绵外敷A型肉毒毒素的治疗组中，100mg高浓度组对肌腱腱周粘连有良好的改善作用，效果接近于几丁糖，统计学结果无显著差异。

3.2.2 HE染色后镜下观测及评分

对损伤肌腱的局部组织取样进行HE染色，镜下显示模型对照组肌纤维排列紊乱，并伴有炎性细胞浸润，而明胶海绵中含有100mg高浓度A型肉毒毒素治疗组的肌纤维排列相对整齐有序，未见明显的炎性细胞浸润，效果接近于几丁糖。通过对肌腱愈合、肌腱粘连和腱周炎症分级表评分可见，高浓度A型肉毒毒素及几丁糖均能有效改善肌腱及腱周组织的愈合，减少局部炎症反应，改善粘连及瘢痕组织形成，作用效果接近。

3.3 ELISA检测局部炎性因子IL-6、TGF-β表达的抑制作用

采用ELISA试剂法测定各组肌腱标本IL-6和IL-6表达含量。在两种A型肉毒毒素浓度条件下，IL-6和TGF-β的表达浓度较模型对照组均有不同程度的下降，浓度越高，抑制作用作为明显，高浓度A型肉毒毒素的抑制效果优于几丁糖。A型肉毒毒素可在一定程度上降低肌腱成纤维细胞中IL-6和TGF-β的表达水平，从而减少腱鞘成纤维细胞向瘢痕组织的转化，避免腱周瘢痕组织增生。

3.4 A型肉毒毒素对肌腱腱周瘢痕粘连抑制作用的思考

A型肉毒毒素对大鼠肌腱损伤后，肌腱愈合、腱周粘连、腱周炎性浸润均有一定程度的改善，抑制腱周瘢痕增生。A型肉毒毒素治疗的优势在于能减少肌肉收缩，降低肌腱修复部位的张力，为肌腱愈合创造相对稳定的环境，从而减少成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成；改善局部血运，为肌腱修复提供更多营养物质和氧气，促进组织修复，减少炎症反应。此外，操作简便安全，局部注射给药，并发症相对较少，多数患者耐受性良好。同时，实验组对A型肉毒毒素对抑制肌腱瘢痕作用提出思考：

3.4.1药物剂量与疗效关系：A型肉毒毒素抑制瘢痕增生的外用剂量选择至关重要。剂量过低可能无法达到理想抑制瘢痕效果，剂量过高则可能增加不良反应风险[12]，如局部肌肉过度松弛、无力等，如何精准确定个体化剂量需进一步研究。

3.4.2长期效果及安全性：实验组设计的实验为短期观察，A型肉毒毒素长期使用对肌腱强度、神经血管、关节功能等影响尚不十分明确，需开展更多大样本、长期随访研究，以全面评估其长期效果和安全性[13]。

3.4.3患者个体差异：不同患者对A型肉毒毒素反应存在差异，如年龄、基础疾病、肌腱损伤程度等因素都可能影响治疗效果，临床应用中需充分考虑这些因素，制定个性化治疗方案[14]。

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基金资助项目：杭州市萧山区科技计划项目 项目编号：2022029）