炎症性肠病中TRIM21表达水平对Th1/Th17细胞分化的影响

摘要：目的 探讨TRIM21表达水平对Th1Th17细胞分化在炎症性肠病中的影响。方法 选取30名健康志愿者（作为对照组）以及60名炎症性肠病（IBD）患者的外围血样本，包括30名克罗恩病（CD组）患者和30名溃疡性结肠炎（UC组）患者；进一步通过定量实时聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学方法，对这些患者的黏膜样本中TRIM21蛋白的表达水平进行检测与分析。外周血CD4+用表达慢病毒的TRIM21（LV-TRIM21）或LV-sh-TRIM21转染T细胞，并检测细胞因子的表达采用定量RT-PCR和ELISA技术。搜集了30位健康志愿者（作为参比组）以及60位炎性肠病（IDB）患者的外围血样本，其中包含30位克罗恩病（简称CD组）和30位溃疡性结肠炎（简称UC组）的病例。针对这些炎性疾病患者，对TRIM21蛋白的表达水平进行了研究，并通过量化的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以及免疫组织化学技术对患者的粘膜样本进行了分析。构建了观测群体，采用三硝基苯磺酸以及表达高水平CD45RB的CD4+ T细胞，建立了诱导性结直肠炎的实验模型，目的是探究这些细胞在引发消化道炎症过程中的功能。结果 采集外周血液中的单个核细胞，经 PMA 与 Ionomycin 共同刺激培养后，运用流式细胞分析技术检测外周血液中 Th1 和 Th17 细胞的比例，并结合病例信息初步探讨这些变化的医学意义。研究发现，TRIM21 的异位表达会抑制炎症性肠病（IBD）中 CD4+T 细胞向 Th1 和 Th17 细胞分化，而 TRIM21 表达下调则产生相反效果。相较于对照组，观察组在给予三硝基苯磺酸后，结肠炎症状更为严重，表现为结肠中 IFN-γ、TNF-α 和 IL-17A 的表达增加。将携带重组基因（Rag1）的 TRIM21、CD45RBhigh CD4+T 细胞移植到小鼠体内，诱导出的结肠炎比野生型对照小鼠更严重。从作用机制来看，干扰素调节因子 3 被视作 TRIM21 的功能性下游靶点，沉默干扰素调节因子 3 可抑制 TRIM21-/- CD4+T 细胞向 Th1 和 Th17 细胞分化。结论 TRIM21 主要在 CD4+T 细胞中表达，与健康人群相比，炎症性肠病患者炎症相关黏膜内的 TRIM21 表达显著降低。因此，TRIM21 有望成为治疗炎症性肠病的潜在有效靶点。

关键词：TRIM21；Th1Th17细胞分化；Th1Th17细胞分化；影响

中图分类号：R574

炎性肠病(IBD)是一种慢性肠道疾病，以非特异性炎症为特征，主要包括克隆氏症（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。对于该疾病的发作原理尚存在不确定性，猜测或许与遗传因素、微生物作用、免疫系统以及环境因素的相互影响有关，这些因素共同引起了易感人群对于共生细菌群发生不正常的免疫响应。研究结果显示，IDB的产生和进程与失常的免疫调控反应紧密相关，尤其是以T细胞介导的免疫反应居于核心地位。T型淋巴细胞主要经历在胸腺的成熟与发育过程，并转变为CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，特别是CD4+ T细胞在细胞免疫反应中扮演着关键角色。首先激活的CD4阳性T细胞会经历分化，演变成多种类型的助理性T淋巴细胞（Th细胞），它们通过分泌多种不同的细胞因子参与了大量炎症性疾病的形成过程。研究表明，Th1/Th17细胞及其细胞因子与IDB的发病机制密切相关。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取30位健康志愿者（作为对照组）以及60位炎症性肠病（IDB）患者的外围血液样本，这些病患包括30位克罗恩病（即CD组）病例和30位溃疡性结肠炎（即UC组）病例。

对照组包括18位男性和12位女性，其年龄跨度为20至79岁，平均（45.87±2.15）岁；CD组患者包括19位男性及11位女性，年龄范围在21至82岁之间，其平均年龄为（46.92±2.59）岁；UC组包含17名男性及13名女性，年龄分布从22岁至85岁，平均年龄近似为（47.20±2.18）岁。这三组患者的基本信息在统计学上差异不显著（P值超过0.05），因此在比较性研究中是相互可比的。

1.2 方法

（1）肠黏膜组织标本收集和处理：于电子结肠镜检查时，取活动期CD患者（n=30例）、UC患者（n=30例）炎症部位肠黏膜组织和非炎症肠黏膜组织部位，以及健康对照者（n=30例）各6块活检肠黏膜组织标本，其中2块行常规病理组织学HE染色检查；4块用于提取总RNA，了解TRIM21 mRNA表达情况。

（2）分离单核淋巴细胞：从30名活动期IBD患者和30名健康个体的外周血中分离PBMC，并从IBD患者的肠道粘膜样本中分离LPMC。

（3）免疫组织化学或免疫荧光染色技术：制作厚石蜡或冰冻组织切片，在普通光学显微镜下观察显色为棕褐色的阳性细胞；参照上述免疫组化染色步骤，制作组织切片，在免疫荧光显微镜下观察阳性细胞分布。

（4）慢病毒转染T细胞：分离外周血CD4+ T细胞，使用anti-CD3/ anti-CD28单抗刺激48小时后，收集激活的CD4+ T细胞，进行慢病毒转染，并分析慢病毒转染效率。

（5）流式细胞仪分析细胞表型：配置细胞悬液，加荧光素标记抗体，利用流式细胞仪分析样本中免疫细胞表达不同分子的水平，计算阳性表达比例。

（6）上清液中各种细胞因子浓度检测：收集细胞培养上清液，用ELISA方法检测培养上清液中的各种细胞因子浓度。

1.3 统计方法

统计分析操作：运用Graphpad Prism 5和SPSS版本13.0的统计软件执行资料的统计学处理，计量数据均用“x±S”形式展示，两个样本平均值的对比采取了r检验方法，而多于三个样本群组的均数对比则通过单因素ANOVA（方差分析）来实施，进一步的成对比较则使用LSD-t检验方式，若p<0.05，则认为差异具有统计学上的显著性。

2 结果

2.1 IDB患者炎症黏膜中TRIM21的表达明显降低

由于TRIM21与多种自身免疫性疾病(如风湿性疾病和SLE)的发病机制有关，本研究发现TRIM21在IDB发病机制中的潜在作用。与hc患者相比，A-CD和A-UC患者炎症黏膜中TRIM21 mRNA表达明显降低。TRIM21 mRNA的表达在缓解期CD或UC患者的肠道粘膜与hcc之间没有显著差异。此外，与来自同一CD或UC患者的未受影响的肠道粘膜相比，炎症粘膜中的TRIM21 mRNA表达也有所降低。

免疫组织化学染色显示进一步TRIM21主要是表达LP结肠粘膜的免疫细胞，而微弱甚至没有表达在上皮细胞。TRIM21-positive细胞的百分比显著减少粘膜发炎的LP pa - tients ibd相比，从高碳钢。因为CDAI和梅奥指数通常用来评估疾病严重程度的CD和加州大学，然后，分别分析了TRIM21表达与CDAI和Mayo指数的相关性。有趣的是，观察到TRIM21在CD或UC患者炎症粘膜中的表达分别与CDAI和Mayo指数评分呈负相关。

然后研究了TRIM21在不同免疫细胞亚群中的表达。为此，从10名健康供者的外周血以及10名结肠癌结肠切除术患者的正常肠黏膜LP中分离CD4+和CD8+ T细胞、CD14+单核细胞和CD20+ B细胞，并使用qRT-PCR检测TRIM21的表达。在外周血和LP中，CD4+ T细胞表达的TRIM21水平明显高于CD11c+树突状细胞和CD20+ B细胞。此外，在ibd患者的外周血和LP中也观察到相同的TRIM21在CD4+ T细胞中的表达模式。

2.2 IDB患者外周血中Th1、Th17 的表达均显著升高

采用流式细胞仪对炎症性肠道疾病患者及健康对照组的外周血液中Th1细胞表达水平进行分析，相关数据见表1。CD组患者体内Th1的比例为(38.32+16.18)%，UC组为(34.23±11.6)%，均显著高于健康对照组的(24.58±10.02)%，差异具有统计学意义(p<0.01)。而比较CD和UC两组患者之间，Th1比例并没有显著性的统计差异（p值大于0.05）。深入研究Th17在健康人群、溃疡性结肠炎患者以及克罗恩病患者中的表达水平。克罗恩病患者的Th17细胞占比（平均值2.51%，标准偏差±1.59%）及溃疡性结肠炎患者的该细胞比例（平均值4.15%，标准偏差+2.75%）在统计上显著高于正常健康人群中的比例（平均值1.44%，标准偏差+0.73%）（两组的p值均小于0.01），而且溃疡性结肠炎患者中Th17细胞的比例明显超过克罗恩病患者（p<0.01）。

表1  炎症性肠病和健康对照者外周血中Th1、Th17 细胞的表达

2.3 炎症性肠病活动期患者外周血中Th1以及 Th17 细胞的表达均明显高于缓解期患者

炎性肠疾病患者发作期时，其外周血液内Th1与Th17细胞水平显著高出康复期。关于这两种细胞在炎症性肠病不同阶段的外周血表达量的统计数据，请参阅表格2。克罗恩病（CD）发作期内Th1细胞在外周血液中的比例高达48.46%±13.83%，而在疾病舒缓期这一比例下降至26.5%±9.24%，差异在统计学上具有显著性（p<0.01）。另一方面，溃疡性结肠炎（UC）患者在病情加重时，外周血中Th1细胞所占比重为37.68%±13.35%，当病情缓解时，该值减少到30.05%±7.41%，此降低趋势亦具备统计学上的显著性（p<0.05）。克隆病（CD）发作时，患者外周血液中的Th17细胞所占比例平均为3.39%，误差范围在1.56个百分点之内；而在克隆病病情稳定期，该数值平均下降至1.48%，误差为0.81个百分点。比较两个时期，发现活动期Th17细胞比例显著高于稳定期，差异具有强烈的统计学意义（p<0.01）。同时，溃疡性结肠炎（UC）患者在活动期的Th17细胞比例平均值高达5.77%，误差范围为2.77个百分点，这一比例在疾病稳定期显著下降至2.18%，误差为0.59个百分点，两个时期之间的差异同样在统计学上非常显著（p<0.01）。

表2  炎症性肠病活动期患者外周血中 Th1 以及 Th17 细胞的表达

2.4 I BD患者体内 Th17/Th1平衡分析

单独对照 IBD病患与健康人群的外围血液中Th17和Th1的比例进行了研究，结果显示UC患者的相关比例显著超过CD患者与健康人群，详细数据见表三。

表3  IBD 患者及健康对照外周血中Th17/Th1的比值

3 讨论

IBD是一种慢性非特异性肠道炎性疾病，包括CD和UC，其发病机制尚不完全明确，可能与遗传、微生物、免疫和环境因素有关 [1-2]。该病可引起肠黏膜组织慢性炎症改变，常造成严重肠道并发症发生（如肠腔狭窄、梗阻、穿孔，甚至癌变），严重影响患者生活质量。近年来流行病学研究报道[3]，我国IBD患者人数呈明显上升趋势。因此，研究IBD发病机制和临床防治凸显重要。

炎症性肠病（IBD）作为一种慢性非特异性肠道炎性疾病，涵盖克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其发病机制错综复杂，涉及遗传、微生物、免疫和环境等多方面因素，至今尚未完全明晰。这一疾病会致使肠黏膜组织出现慢性炎症性改变，引发肠腔狭窄、梗阻、穿孔甚至癌变等严重并发症，极大地降低患者的生活质量。近年来，我国 IBD 患者数量呈显著上升态势，因此，深入探究 IBD 的发病机制并寻求有效的临床防治策略显得尤为关键。

已有研究表明，免疫调控异常在 IBD 的发展进程中起着核心作用，其中 T 细胞介导的免疫反应占据重要地位。T 淋巴细胞在胸腺发育成熟后分化为 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞 ，而 CD4+ T 细胞在细胞免疫反应中扮演关键角色。激活后的 CD4+ T 细胞可分化为多种辅助性 T 淋巴细胞（Th 细胞）亚型，通过分泌不同的细胞因子参与众多炎症性疾病的发生发展。在 IBD 的发病过程中，Th1/Th17 细胞及其分泌的细胞因子发挥着重要作用。例如，UC 患者的肠道微生物会诱导 T 细胞释放 Th2 和 Th17 相关细胞因子；CD 患者的炎症性肠黏膜则大量产生与 Th1 和 Th17 响应相关的促炎因子，如干扰素 -γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、IL-17A 等。这些激活的免疫细胞和分泌的炎症因子会进一步放大肠道黏膜的免疫反应，加剧肠黏膜的免疫病理损伤 。然而，Th1 与 Th17 细胞引发炎症以及炎症性细胞因子过量生成的具体调控机制仍不明确。

TRIM21 属于 TRIM 蛋白家族，具有 E3 泛素结合酶功能，主要在 T 淋巴细胞、巨噬细胞和 NK 细胞等免疫细胞中表达。在风湿性疾病和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中，TRIM21 已被证实发挥着重要的免疫调节作用。但在 IBD 中，其是否参与肠黏膜炎症损伤以及具体作用机制尚未见详细报道。本课题组前期研究发现，TRIM21 主要在 CD4+ T 细胞中表达，且在 IBD 患者肠黏膜中的表达显著降低。体外培养健康者外周血 CD4+T 细胞并经 anti-CD3/anti-CD28 单抗刺激后，TRIM21 的表达明显下降。给予不同浓度的细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-6、IL-23）辅助刺激时，发现 IL-6 可显著降低外周血 CD4+T 细胞 TRIM21 的表达。通过慢病毒转染技术上调 CD4+T 细胞 TRIM21 的表达，能有效抑制 Th1 和 Th17 相关细胞因子及转录因子的表达；下调 TRIM21 则会使其表达升高。这些结果初步表明 TRIM21 可能参与了 IBD 患者肠黏膜组织内 Th1 和 Th17 细胞介导的免疫病理损伤过程。

本研究通过对 IBD 患者和健康对照者外周血中 Th1 和 Th17 细胞表达水平的检测发现，CD 组和 UC 组患者 Th1 细胞比例均显著高于健康对照组，且 UC 组患者 Th17 细胞比例显著高于 CD 组和健康对照组。这提示 TRIM21 表达减少与肠黏膜炎症之间可能存在关联，但其具体机制还需进一步深入研究。此外，研究还发现 IBD 患者发作期外周血中 Th1 和 Th17 细胞水平显著高于缓解期，这表明 Th1 和 Th17 细胞不仅参与了 IBD 的发病，还可能在疾病的进展和恶化过程中发挥作用。

在 IBD 的免疫机制研究中，T 细胞辅助型 1/2（Th1/Th2）失衡调控理论已得到广泛认可，CD 被认为是由 Th1 型细胞因子触发的炎症，临床使用抗 TNF 和抗白细胞介素 - 12 的抗体治疗 CD 取得显著效果，进一步证实了这一理论。然而，将 UC 完全定义为 Th2 型疾病的证据尚不充分。Th17 细胞在 CD 和 UC 患者体内的异常活性被发现，暗示其在 IBD 发生过程中可能具有重要作用，这也为 IBD 的研究补充了新的方向。

综上所述，本研究聚焦于 TRIM21 在 IBD 病理生理发病过程中的免疫调节作用，深入探究其在 IBD 患者肠黏膜组织内的表达水平、原位表达、细胞亚型的表型分布，以及对肠黏膜组织内 CD4+ T 细胞增殖分化、免疫应答效应调节和靶向基因表达调控的影响。若能明确 TRIM21 在 IBD 中的作用机制，有望为 IBD 治疗找到新的靶点，为临床治疗提供重要的理论依据，推动 IBD 治疗领域的发展，改善患者的预后和生活质量。

参考文献

[1] Nishida A, Inoue R, Inatomi O, et al. Gut microbiota in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J]. Clin J Gastroenterol. 2018;11(1):1-10.

[2] Sartor RB, Wu GD. Roles for Intestinal Bacteria, Viruses, and Fungi in Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases and Therapeutic Approaches[J]. Gastroenterology. 2017;152(2):327-339.e4.

[3] Yang Y, Owyang C, Wu GD. East Meets West: The Increasing Incidence of Inflammatory Bowel Disease in Asia as a Paradigm for Environmental Effects on the Pathogenesis of Immune-Mediated Disease[J]. Gastroenterology. 2016;151(6):e1-e5.

[4] Zhang YZ, Li YY. Inflammatory bowel disease: pathogenesis[J]. World J Gastroenterol. 2014;20(1):91-99.

[5] Gaffen SL, Jain R, Garg AV, et al. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing[J]. Nat Rev Immunol. 2014;14(9):585-600.

[6] Zhu J. T Helper Cell Differentiation, Heterogeneity, and Plasticity[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018;10(10):a030338.

[7]吴超,张海荣,于伟等.Th17及其相关细胞因子在炎症性肠病中的免疫调控作用[J].中国医师杂志,2022,24(08):1270-1273.

[8] 袁余懿,刘与进,范恒.Th17细胞及其相关细胞因子在IBD中研究新进展[J].世界华人消化杂志,2021,29(24):1402-1409.

[9] Yang J, Sundrud MS, Skepner J, et al. Targeting Th17 cells in autoimmune diseases[J]. Trends Pharmacol Sci. 2014;35(10):493-500.

[10] Jacob N, Targan SR, Shih DQ. Cytokine and anti-cytokine therapies in prevention or treatment of fibrosis in IBD[J]. United European Gastroenterol J. 2016;4(4):531-540.

[11]Chen ML, Sundrud MS. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases[J]. Inflamm Bowel Dis. 2016;22(5):1157-1167.

[12]Krausgruber T, Schiering C, Adelmann K, et al. T-bet is a key modulator of IL-23-driven pathogenic CD4(+) T cell responses in the intestine. Nat Commun. 2016;7:11627.

[13]Chapuy L, Bsat M, Mehta H, et al. Basophils increase in Crohn disease and ulcerative colitis and favor mesenteric lymph node memory TH17/TH1 response[J]. J Allergy Clin Immunol. 2014;134(4):978-81.

[14] Yoshimi R, Chang TH, Wang H, et al. Gene disruption study reveals a nonredundant role for TRIM21/Ro52 in NF-kappaB-dependent cytokine expression in fibroblasts[J]. J Immunol. 2009;182(12):7527-7538.

[15] Espinosa A, Zhou W, Ek M, et al. The Sjogren's syndrome-associated autoantigen Ro52 is an E3 ligase that regulates proliferation and cell death[J]. J Immunol. 2006;176(10):6277-6285.

[16] Oke V, Wahren-Herlenius M. The immunobiology of Ro52 (TRIM21) in autoimmunity: a critical review[J]. J Autoimmun. 2012;39(1-2):77-82.

[17]Bolland S, Garcia-Sastre A. Vicious circle: systemic autoreactivity in Ro52/TRIM21-deficient mice[J]. J Exp Med. 2009;206(8):1647-1651.

[18] Brauner S, Zhou W, Backlin C, et al. Reduced expression of TRIM21/Ro52 predicts poor prognosis in diffuse large B-cell lymphoma patients with and without rheumatic disease[J]. J Intern Med. 2015;278(3):323-332.

[19] Zhou G, Wu W, Yu L, et al. Tripartite motif-containing (TRIM) 21 negatively regulates intestinal mucosal inflammation through inhibiting TH1/TH17 cell differentiation in patients with inflammatory bowel diseases[J]. J Allergy Clin Immunol. 2018;142(4):1218-1228.

作者简介：刘慧(1986.02—),女,汉族,河南商丘人,硕士学位,副主任药师,研究方向:肿瘤临床药学

刘亚清(1988.07—),男,汉族,河南商丘人,硕士学位,副主任医师,研究方向:炎症性肠病｡

基金项目：2023年商丘市科技发展指导性计划项目（项目编号：）项目名称：TRIM21通过抑制Th1/Th17细胞分化调控炎症性肠病发生发展及机制研究。