短期（1-4周）不同温度无水甘油保存人角膜基质透镜的活性成分稳定性研究

摘要：本研究探讨无水甘油在短期（1-4周）内4℃、37℃、-20℃三个温度条件下保存人角膜基质透镜的活性成分稳定性。通过对保存不同时间的角膜基质透镜进行细胞活性、胶原含量、蛋白水解酶活性等指标检测，发现4℃条件下活性成分稳定性最佳，4周内各项指标变化较小；37℃条件下活性成分最差，细胞活性下降显著，胶原含量降低，蛋白水解酶活性大幅升高；-20℃虽能一定程度抑制代谢，但存在潜在风险。研究结果为临床角膜基质透镜的短期保存提供了温度选择参考依据，有助于提高角膜保存质量和移植成功率。

关键词：无水甘油；角膜基质透镜；温度；活性成分；稳定性

一、引言

角膜移植是治疗角膜疾病致盲的有效手段，而角膜的保存是角膜移植成功的关键环节之一。角膜基质透镜作为角膜的重要成分，其活性成分的稳定性直接影响角膜移植后功能的恢复。无水甘油因良好的脱水和保存性能，在角膜保存中应用广泛，但无水甘油保存角膜基质透镜活性成分的稳定性受保存温度影响尚不明确。不同温度会对角膜基质细胞的代谢活动、胶原纤维的结构、蛋白水解酶的活性等产生影响，在短期保存过程中，选择合适的保存温度对维持角膜基质透镜的活性成分、提高角膜移植成功率意义重大。目前临床上角膜短期保存温度的选择存在争议，缺乏系统研究数据。因此，本研究通过设置不同温度实验组，对无水甘油保存的人角膜基质透镜活性成分稳定性进行短期（1-4周）研究，旨在为临床角膜保存提供科学的温度选择依据。

二、材料与方法

（一）实验材料

角膜来源：本研究使用的人角膜基质透镜均来源于自愿捐献的角膜组织。所有捐献者在捐献前均由直系亲属签署《角膜捐献知情同意书》，并严格遵循《眼库管理规范》进行医学筛查。筛查项目包括但不限于：HIV抗体（ELISA法，采用北京万泰生物诊断试剂盒）、梅毒螺旋体抗体（TRUST法及TPPA法双检）、乙型肝炎表面抗原（电化学发光法）、丙型肝炎抗体（化学发光法），以及眼部裂隙灯显微镜检查、角膜内皮细胞计数（使用非接触式角膜内皮显微镜Topcon SP-3000P，要求细胞密度≥2000个/mm²，六角形细胞比例≥60%），以排除患有传染性疾病、眼部感染、圆锥角膜等影响角膜质量的因素。捐献角膜均经眼库工作人员在生物安全柜内完成基质透镜分离，采用飞秒激光制瓣技术（VisuMax全飞秒手术系统，德国蔡司公司）制备直径9.0mm、厚度120-150μm的基质透镜，制备后立即转入保存体系。

保存试剂：选用国药集团化学试剂有限公司生产的无水甘油（分析纯，CAS号：56-81-5，批号：20231205）作为保存试剂。使用前采用高压蒸汽灭菌法处理（121℃，15分钟），灭菌后于超净工作台内分装至无菌西林瓶，每瓶含5ml甘油，并添加终浓度为1%的青霉素-链霉素双抗（Gibco公司，15140-122），密封后置于4℃冰箱备用。使用时将角膜基质透镜完全浸没于甘油保存液中，确保保存环境的无菌性与稳定性。

实验仪器：CO₂培养箱为美国Thermo Fisher Scientific公司生产的3111型二氧化碳培养箱，控温精度±0.1℃，CO₂浓度控制范围0-20%，内置HEPA过滤器，确保无菌培养环境；倒置相差显微镜是日本Nikon公司Eclipse Ti-E型号，配备10×、20×、40×相差物镜，支持明场与相差成像模式切换，用于细胞及角膜组织形态学观察。

（二）实验方法

将采集的新鲜角膜在无菌条件下用显微器械制备成厚度均匀的角膜基质透镜，直径6.5mm左右，厚度150-200μm左右。

采用CCK-8法检测细胞活性。在每个时间点取相应实验组的角膜基质透镜剪碎后加入含有CCK-8试剂的培养基中，37℃孵育2h。然后用酶标仪在450nm处测定吸光度值，吸光度值越高，细胞活性越高。采用羟脯氨酸测定法测定胶原含量。取角膜基质透镜样水解，提取羟脯氨酸，用比色法测定羟脯氨酸含量，推算出胶原含量。采用特定的蛋白水解酶底物，用角膜基质透镜样本的匀浆与底物混合，在适当条件下反应一定时间后，通过检测反应产物的生成量来测定蛋白水解酶活性。

（三）统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差，表示（xˉ±s），组间比较采用单因素方差分析One-way ANOVA，如果差异有统计学意义P<0.05，则进一步采用LSD-t检验进行两两比较。P<0.05认为差异有统计学意义。

三、结果

（一）细胞活性检测结果

表1不同温度和保存时间下角膜基质透镜的细胞活性变化

保存第1周时，三组细胞活性无显著差异（P>0.05）。随着时间延长，4℃组细胞活性下降最为缓慢，4周时仍维持较高水平；37℃组活性下降极为明显，4周时OD值降至0.38±0.05；-20℃组虽能维持一定活性，但低于4℃组（P<0.05）。在保存初期（1周），4℃组、37℃组和-20℃组细胞活性OD值分别为0.85±0.03、0.82±0.04和0.83±0.03，经单因素方差分析显示组间差异无统计学意义（P>0.05），说明短期内各温度条件对细胞活性影响较小，无水甘油保存体系在初始阶段能有效维持细胞活性。

（二）胶原含量测定结果

表2不同温度和保存时间对角膜基质透镜胶原含量的影响

在保存初期（1周），4℃组、37℃组和-20℃组的胶原含量分别为120.5±5.2μg/mg、118.0±4.8μg/mg和119.0±5.0μg/mg，经单因素方差分析，组间差异无统计学意义（P>0.05），表明短期内温度尚未对胶原含量造成明显影响，无水甘油保存体系在初始阶段可有效维持胶原的相对稳定。

四、讨论

温度是影响细胞活性的重要环境因子，其对细胞代谢和存活状态影响显著。本研究中无水甘油保存的角膜基质透镜细胞活性在不同温度条件下存在差异，背后有着复杂的生物学机制。4℃低温对细胞活性的保护作用主要源于其对细胞代谢的抑制效应。低温减慢了分子的热运动，使参与代谢的酶与底物的碰撞频率和有效结合概率大幅降低，细胞内生化反应速率显著下降。37℃接近人体生理温度，细胞代谢活动极为活跃。然而，无水甘油保存体系缺乏细胞维持正常代谢所需的营养物质、适宜电解质环境和必需生长因子等条件。在这种情况下，细胞不断进行代谢，却无法及时补充消耗的能量和物质，代谢废物也不能有效排出，导致细胞内稳态失衡。随着保存时间延长，细胞因能量耗竭、代谢紊乱和毒性物质积累而迅速衰亡，这解释了37℃组细胞活性快速下降的现象。-20℃低温虽能抑制细胞代谢过程，但也存在潜在风险。在降温过程中，细胞内水分结冰形成冰晶，冰晶的生长和膨胀会对细胞膜、细胞器甚至细胞核造成物理性损伤。冰晶的机械压力可导致细胞膜破裂，破坏细胞完整性，还可能引起细胞内溶质浓度局部升高，造成细胞脱水和电解质失衡，影响细胞活性，这使得 - 20℃组细胞活性虽能维持一定水平，但低于 4℃组。

结论

本研究系统探究了无水甘油在 4℃、37℃、-20℃条件下，对人角膜基质透镜进行 1 - 4 周短期保存时，其活性成分稳定性的变化规律。研究结果表明，4℃保存条件下，角膜基质透镜的细胞活性下降最为缓慢，4 周后仍能维持较高水平；胶原含量降幅最小，有效保持了角膜基质的结构完整性；蛋白水解酶活性升高幅度最低，减缓了角膜基质内蛋白质的分解，该温度能够最大程度维持角膜基质透镜活性成分的稳定性，是短期保存的最佳温度选择。37℃条件下，细胞代谢活跃，蛋白水解酶活性显著升高，导致细胞活性下降明显，胶原含量快速降低，保存效果最差。-20℃虽能一定程度抑制代谢，但存在细胞内冰晶形成破坏细胞结构的风险，影响细胞长期活性和胶原结构稳定性，保存效果不及 4℃理想。

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基金项目：通用医疗2022年度科研基金项目，编号：TYYLKYJJ-2022-027