宏基因组二代测序在感染性疾病中的应用进展

感染性疾病是机体感染细菌、病毒、真菌等病原微生物后引起的一系列病理生理过程^[1]。患者临床表现症状随感染部位不同而有所差异，严重感染者较易出现败血症、感染性休克、多器官功能衰竭等并发症。感染性疾病发病率随环境恶化、人口老龄化等因素与日俱增，给全球的卫生健康事业造成严重负担。感染性疾病治疗的关键点在于快速明确感染性病原体，再予以针对性的抗感染治疗，传统的病原体检测包括细菌培养、血清学抗体检测等，具有检测周期长、阳性率低等缺陷，近年来新兴的病原体核酸检测（荧光定量PCR技术）和下一代基因测序（Next Generation Sequencing，NGS）是目前病原体检测的新方向。下一代基因测序又称二代测序或高通量测序，是一种将数百万甚至数亿条DNA片段同时和独立测序的技术，在病原微生物检测中的应用包括全基因组测序、16rRNA基因测序和宏基因组二代测序（mNGS）^[2]。mNGS可以直接从人体体液或组织样本中提取全部微生物的DNA或RNA，再对这些核酸进行大规模的平行测序，能够检测出样本中存在的各种已知和未知的微生物核酸序列，最后经过与微生物基因组数据库进行比对，确定微生物的种类^[3]。本文将对mNGS在感染性疾病中的应用进行总结。

1NGS发展简史

第一代测序（也称为Sanger测序）始于1977年链式分解和化学降解方法的发明^[4]。Sanger测序是金标准，读取长度为1000bp的DNA精度高达99.99%，但也具有成本高、通量低、测序时间长等缺陷，这些缺陷限制了测序在临床检测中的大规模应用。随着测序方式的改进，多种高通量测序系统被推出，包括Roche公司的454系统、Illumina公司的Solexa系统以及ABI公司的Solid 系统。随着这些高通量系统的推出，测序技术的临床应用的瓶颈被突破，得以在临床检测中广泛应用。宏基因组学（mNGS）正是在此种背景下得以迅速的发展，mNGS在发现SARS冠状病毒、构建癌症突变的基因图谱、对人体不同部位的微生物组学进行分析取得了良好的应用^[5]。mNGS在检测病原体时，无需进行培养、无需预设、通过无偏好性的提取临床样本中的DNA或RNA片段，直接对样本中所有核酸进行高通量测序、数据库比对和智能化算法分析，能够快速、准确的判断致病病原微生物的种类，mNGS对于样本类型的要求也不高，几乎可覆盖人体的全部样本类型，尤其是对脑脊液等低病原含量无菌体液样本的检测中具有显著优势，可大大提升其检测的阳性率^[6]。

2mNGS的工作流程

2.1 样本采集：在样本采集中，几乎所有类型的临床样本均可应用于mNGS的检测中，需注意的是，为提高检测的特异性和敏感度，应结合临床疾病类型选择最为合适的临床样本，如对于中枢神经系统感染，脑脊液是最为理想的检测样本，而对于深部肺部感染，肺泡灌洗液显著优于痰液和咽部拭子。对于样本采集，最重要的是采集过程中严格遵循标准操作流程，进行无菌操作，减少样本被皮肤表面或环境中的微生物污染，以避免假阳性的发生。

2.2 核酸提取与纯化：为将临床样本中的所有微生物的核酸进行全部提取，常需应用特殊的核酸提取试剂盒，临床应用较为广泛的是磁珠法核酸提取试剂盒，这类试剂盒可有效裂解细胞释放核酸，去除蛋白质、多糖等杂质，利用磁珠与核酸特异性结合，通过洗涤和洗脱步骤获得纯净的核酸。对于检测血液样本中的病毒核酸，为提高病毒核酸的相对含量，减少人体细胞核酸对病毒核酸检测的干扰，需进行宿主核酸去除，常用基于CRISPR - Cas系统的宿主核酸选择性切割技术，或者使用能够特异性结合宿主核酸的试剂进行去除。

2.3文库构建与扩增：在此过程中，为使核酸片段的大小符合测序平台的要求，常采用超声破碎或酶切的方法，对提取的核酸进行片段化处理，将长链核酸打断成平均长度为几百个碱基对的片段。然后再进行末端修复和接头连接，测序接头是一种特殊的寡核苷酸序列，它包含了用于与测序平台引物结合的区域以及识别标签。这些标签可以区分不同的样本和核酸片段，方便后续的测序和数据分析。此外，为保障测序文库量的充足，也会应用聚合酶链式反应（PCR技术）对构建好的文库进行扩增，但扩增即有偏差，因而，对于文库均一性要求高的样本，应减少或避免进行扩增。

2.4 高通量测序：目前应用广泛的二代测序平台有Illumina公司的MiSeq、NextSeq 和NovaSeq等系列，以及华大基因的BGISEQ系列等。测序过程为将构建好的文库加载到测序平台上，按照平台的操作流程进行测序。在测序过程中，测序平台将产生大量的测序读长（reads），这些读长是对核酸片段序列的记录。需注意的是，对于低微生物载量的样本，需增加测序深度，即每个碱基被测序的次数，以确保其检测敏感性。

2.5生物信息学分析：测序完成后，需对测序的数据进行质量控制，这个过程常采用专业的生物信息学工具进行，如采用FastQC来评估数据质量，使用Trimmomatic等工具进行读长修剪。经过质量控制的数据接着再与已知的微生物基因组数据库进行比对，通过比对算法，确定读长所属的微生物病原体种类，并根据读长的数量和分布来计算病原体的相对丰度。需注意的是，任何病原体的确定，均需结合临床症状、病史和其它实验室结果进行综合判断。

3mNGS技术在感染性疾病中的应用

   3.1 mNGS技术在神经系统感染中的应用。中枢神经系统感染是指由病毒、细菌或真菌等侵染中枢神经系统引起的急性或慢性炎症性疾病，具有较高的致死率，且常遗留严重的后遗症。受检测通量和灵敏度的限制，常规的检测方法对于病原体的检出率极低，宏基因组测序是一种新兴的病原检测技术，能够极大地提升病原检出率。在2014年，Wilson等利用mNGS 确定了一名病因不明、反复发热及免疫缺陷症的脑炎患者的病因为钩端螺旋体感染^[7]。Miller等采用mNGS技术对95份CSF样本进行检测，结果显示其灵敏度和特异性分别达到了73%和99%^[8]。这些临床研究结果为mNGS在中枢神经系统感染的广泛应用奠定了坚实的基础。同时，mNGS技术在对于中枢神经系统罕见病原体和未知病原体感染层面也具有巨大的优势。

3.2 mNGS技术在呼吸系统感染中的应用。呼吸系统感染是最为常见的感染类型，mNGS在呼吸系统感染的应用极为广泛，可大大提升呼吸系统病原体的诊断效率，QIAN等同时对100例肺部感染患者的呼吸道样本进行常规培养和mNGS检测，结果显示，mNGS对病原 菌和真菌的检测灵敏度高于常规培养^[9]。在呼吸道病毒检测层面，mNGS的灵敏度和特异度低于PCR检测方法，但其在检测罕见和新型未知病毒层面具有较大优势^[10]。

3.3 mNGS技术在血流感染中的应用，血流感染检测的金标准为血培养，然而传统的血培养检测所需时间长，培养的阳性率也有所局限，对于某些特殊细菌，如结核分枝杆菌、诺卡氏菌等，常难以培养，对于病毒感染，则无法培养。而有临床研究显示，在血流感染发作前几天，mNGS即可通过血液中游离细胞的DNA序列对病原体进行识别^[11]，GUMAZ等对48名脓毒患者进行了7个时间点256份血浆样本取样，并进行mcfDNA分离和血培养，结果显示，研究期间血培养的阳性率仅为11%，而mNGS则达到了71%^[12]。此外，另一研究纳入124例重症脓毒患者，不仅发现mNGS的检测阳性率显著高于血培养，且还发现了１例肺孢子虫、１例结核病原体及罕见的吉罗维肺孢子虫^[13]。

4mNGS检测的缺陷和局限性。

mNGS技术弥补了传统病原学检测的缺陷，提升了检测的特异性和敏感度，能够快速、客观的对临床样本中的多种病原微生物进行检测，是感染性疾病进行精准治疗的前提和基础。但mNGS技术仍存在着短板和缺陷，其缺乏标准化的数据处理和数据分析方式，对于临床样本的前处理标准也尚未建立，且由于采样、检测过程中污染带来的假阳性结果和核酸降解带来的假阴性结果也不能完全避免^[14]。此外，其检测成本仍处于较高水平，对于后期数据的处理和分析也需专业的生物信息人才，降低检测成本，培养专业人才是mNGS技术进一步推广的重要措施。

综上所述，mNGS技术在感染性疾病的病原体检测中展现出巨大的应用前景，mNGS是一项革命性的技术，它通过一次测试可识别所有的病原体，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫。且在难以检测的、罕见的和新发的病原体检测层面具有其独特的优势。但仍有其局限性，因而，目前无法完全取代传统检测，与传统检测和其他分子生物学检测相结合，对于感染性疾病的诊断是获益最大的。

参考文献

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