液相色谱串联质谱法应用于分析血清中脂溶性维生素性能的价值探讨

【摘要】目的：探究液相色谱串联质谱法应用于分析血清中脂溶性维生素性能的价值。方法：选择我院2024年3月—2025年4月体检人群7669例，应用HPLC-MS技术对其血浆中的脂溶性维生素进行检测。结果：采用HPLC-MS对血浆中脂溶性维生素进行定量分析，脂溶性维生素 K1数量为1413，脂溶性维生素 A数量为1412，脂溶性维生素E数量为1412。定量结果分析：count（4237.00）、mean（175.31）、std（261.70）、min（0.02）、25%（1.53）、50%（6.40）、75%（390.31）、max（1511.46）。结论：HPLC-MS是适用于血清中脂溶性维生素含量的分析方法，具有线性范围广、灵敏度高、精密度高等突出优点，在临床诊断和营养评价等方面显示了巨大的应用潜能，有望作为一种重要的分析方法，帮助临床和健康评估工作的开展。

【关键词】液相色谱串联质谱法；血清；脂溶性维生素；性能；检测价值

脂溶性维生素（fat-soluble vitamins）是人体生长发育所必需的微量元素，由维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等组成，与心血管系统、内分泌系统及骨骼健康有着重要的关系[1]。脂溶性维生素尤其是维生素D含量不足的人群较为常见，而女性又是其中最易发生脂溶性维生素不足的人群，因此备受关注。因此对产妇血清中的脂溶性维生素检测不仅能够保障产妇的健康水平，同时能够及早诊断胎儿早产、妊娠糖尿病等异常情况，并且采取针对性措施给予对症治疗，从而减少妊娠风险[2]。目前对脂溶性维生素检测以高效液相色谱法、质谱法，但这些检测方法对血液需求量较高、检测项目单一，难以满足临床多项快速检测的需求，尤其是孕产妇采血量难以满足需求[3]。针对这一问题，我院采用液相色谱串联质谱法进行研究，以期对孕妇合理补充脂溶性维生素提供准确参考，尽早干预脂溶性维生素缺乏或相关疾病。

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1主要仪器

采用英盛ys9900。

1.2方法

1.2.1色谱条件

（1）色谱柱：KinetexⓇ2．6μm C18 3×30 mm)；流量：0.70 ml/分钟；样品体积：10µL。（2）浓度为0.1%的甲酸盐的移动相；以0.1%的甲酸甲酯为色谱柱，以流动相为流动相，得到了相应的液相分布。

1.2.2实验步骤

1.2.2.1制备内标浓缩液和工作溶液

（1）取120μl复溶液加入到内标干粉小瓶中，涡旋振荡1min，制备后内标浓缩液液于-18°C或以下条件保存。

（2）依据待测样本数计算内标工作溶液的量，接1200体积比例用提取液A96释内标浓缩液，将液体彻底混匀，内标工作液需现用现配。

1.2.2.2制备校准品溶液

（1）制备校准品稀释液：

取2ml纯水加入至校准品稀释液的小瓶中，溶解混匀，制备后的稀释液于-18C或以下条件保存。

（2）制备校准品溶液：取mL纯水加入校准品的小瓶中，溶解混匀，制备后的校准品于-18℃

或以下条件保存。

1.2.2.3制备质控品溶液

各取0.7mL纯水加入至质控I、质控Ⅱ小瓶中，溶解混匀，制备后的质控品于-18C或以下

条件保存。

1.2.2.4配制标准曲线

取7个1.5mLEP管（S1~S7），向S1~S6中分别加入200gL校准品稀释液，向S6、S7中加入校准品溶液200uL，吹打混匀S6，移取200gLS6加入S5中，吹打混匀后从S5移取200uL加入S4中，依次逐级1：1等比稀释（具体浓度已试剂盒靶值表为准）。

1.2.2.5样本制备

（1）取200gL血清、质控品至1.5mLEP管中，加入150uL内标工作液：

（2）加入800uL提取液C，涡旋振荡3min：

（3）置离心机中，12000rpm，离心5min

（4）取上清液600uL至96孔收集板中，注意不要取到下层水相，氮气吹干（约10min）：

（5）每孔加入100uL复溶液，700rpm涡旋混匀2min，盖上硅胶垫，检测备用。

1.2.2.6试剂盒储存条件及有效期

校准品、质控、内标、校准品稀释液及衍生液在-18C或以下避光密封存储，其他组分

0°C~30C避光密封存储，试剂盒自生产之日起有效期为12个月：

开封后试剂（提取液A、提取液C、复溶液、流动相A、流动相B）尽量密封后在0C～30

条件保存稳定1个月：衍生液尽量密封后在-18C或以下条件保存稳定1个月：

1.2.3评价指标

本文参考《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》，建立评估方法。1．2．4评价指标

样品预处理后添加法：（a）将高、中、低3种浓度的标准液（S2,S3,S4）添加到样品中，各6个样品平行，各样品测量一次。（b）将高浓度、中浓度和低浓度的三个浓度（S2,S3,S4）进行进样，检测其峰反应值之比（MF）＜1，说明样品中有明显的离子干扰。当MF＞1时，说明样品中有明显的离子增强作用。

首先将低浓度样品（直线最低点S1）反复取样，再将高浓度样品（直线最高点S7）与低浓度样品进行交叉进样。S1为低浓度样品，S7为高浓度样品，采样次序为S7-S1-S7-S1-S1-S7-S1。分别对不同浓度、不同浓度样品进行测量，分别求取未受污染样品（A1代表）和可能受污染的低浓度样品的平均（A2代表）。细菌的带菌量=(A2-A1)/A1/100%。评定指标：空气中的污染物含量不超过20%。

1.3数据处理

采用SPSS25.0对数据进行统计学处理。计量数据以x±s表示，多变量变异数（%）表达，X2检验；经统计学处理，P＜0.05。

2结果

2.1项目分布检查结果

三种脂溶性维生素的分析项目数量非常接近，分布较为均衡，具体见表1。

表1项目分布检查结果

2.2定量结果分析

标准差（std）为 261.70 相对较大，这表明定量结果的离散程度较高；最小值为 0.02，最大值为 1511.46，跨度较大；大部分样本的定量结果集中在 1.53 - 390.31 这个区间内。具体结果见表2.

表2定量结果分析

3讨论

液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）是由高效的液相、色谱和串联质谱两部分组成。在对样品进行预处理的基础上，利用液相层析实现对样品的有效分离，并将其电离为荷电离子，最后送入质谱仪。采用基于原子电荷比例（m/z）的方法对待检测组分进行分离，实现对样品的高选择性、高灵敏检测。目前，液质联用技术已被用于新生儿的基因代谢疾病筛查，维生素含量的检测，血液中的类固醇激素的检测。

本次研究结果显示，2024年3-5月的样品采集量很小，并且保持了一个比较平稳的状态，这可能是因为这个时期的采样工作还处于起步阶段，采集资源有限，也可能是由于季节性的原因，相应的服务需求量不大。从2024年6月起，样品收集量明显增加，这是因为企业业务扩大，宣传效果显现，还是企业进入了旺季。2025年3月达到峰值，4月再次大幅回落，这可能是因为本月出现了一些特殊情况（比如资源调配、政策调整等）。目前，由于缺乏能够直接反映其性能的相关指标（如准确度、精密度、灵敏度等），因此，其在测定血清中脂溶性维生素特性时遇到了一些困难。经筛查，所得样品为血清，各项指标均以脂溶性维生素为主，共4237条。这说明，在整个数据库中，存在着大量的血液中脂溶性维生素的样品，这为进一步研究这种检测技术的效能奠定了基础。从整体上看，每一栏都有不同程度的遗漏，但总体上是相当大的，对后面的分析也比较有帮助。

三种脂溶性维生素的测定研究数目相近，且在各指标中的分配也比较平衡。这就意味着，上述三种维生素在血清脂溶性维生素测定中都有相同的注意和分析要求。因此，本研究拟采用LC-MS/MS联用技术，实现对多种维生素的快速、准确、快速、准确地测定。标准偏差（std）为261.70，是一个比较大的数值，说明定量结果具有很高的离散性。这主要是由于样品的个体差异，分析过程中存在的误差，以及分析方法的稳定性等。当检测方法有问题时，还需对检测条件进行进一步的优化，以提高检测结果的稳定性。其最小值和最大值分别为0.02和1511.46，具有很大的跨距。结果表明，所建立的测定方法可以对多种脂溶性维生素进行测定，具有很好的应用前景。因此，液相色谱-质谱联用技术可以更广泛地用于测定血液中的脂溶性维生素，既可以测定低浓度的维生素，也可以测定高浓度的维生素。中间值（50%）、25%（1.53）和390.31 （75%）。这说明对于大多数样本而言，数量上的结论是在1.53-390.31之间。基于此，本研究将着重评价并优化该浓度范围内的分析方法，从而提高其检测精度。

液相色谱串联质谱法所建立的方法具有较大的线性范围，可适用于多种浓度的食品中，对微量或高浓度的脂溶性维生素进行检测，而不需要经过烦琐的稀释或浓缩，从而达到较好的检测效果，可以同时满足不同人群对维生素的测定需要。可实现在血液中微量脂溶性维生素的高灵敏、高灵敏度、高灵敏度的快速、灵敏、高灵敏的分析，为疾病的预防、诊断及疗效监控提供了新的思路。如某些特定群体（如孕妇、老人等），其高灵敏检测可使其早期检测出潜在的健康问题。对同一批样品进行多次测定，或分批测定，其测定值波动均很小。高精度的分析方法可以确保分析结果的可靠性与准确度，从而实现多个实验室间的比较，从而提高临床诊疗研究的一致性与可重复性。采用高效液相色谱-质谱联用技术，快速、准确、快速、准确地检测出目标物中的维生素。本项目将为临床检验结果的真实、高效、准确地保证，并为临床诊疗方案的制定提供科学依据。

液质联用技术可用于血清中脂溶性维生素的测定。该方法可实现对多种脂溶性维生素的同步测定，拓宽了检测范围，实现了对多组分样品的快速测定。但是，由于测定结果的离散性较大，因此对其分析方法的稳定性及准确度提出了更高的要求。同时，本研究还将进一步探索其在临床诊断和健康评价等领域的应用价值。

参考文献：

[1]李敏,孙江漫,孟祥兆,等.液相色谱串联质谱法检测脂溶性维生素模拟校准品基质的选择和评价[J].标记免疫分析与临床,2024,31(11):2056-2061+2098.

[2]贾永娟,邱天祎,刘杏立,等.正常饮食对脂溶性维生素检测结果的影响[J].检验医学,2024,39(03):289-290.

[3]于鹏，周传贵，楚士颖，等。建立LC-MS/MS检测血清中5种脂溶性维生素的方法及临床验证[J].检验医学与临床,2024,21(06):721-725+732.

[4]屈赐福,郑东,丁海容,等.液相色谱串联质谱法分析血清中脂溶性维生素的性能评价及临床应用[J].临床检验杂志,2023,41(12):881-885.

[5]程峰,樊卫民,陈亚军.血清脂溶性维生素水平对多囊卵巢综合征的预测效能评价[J].中国妇幼保健,2023,38(22):4398-4401.